Surveillance de l’infection bactérienne et de l’administration de protéines effectrices dans les cellules végétales

Résumé

Source : Lee, H. et. al., Système de protéines fluorescentes vertes divisées pour visualiser les effecteurs délivrés par les bactéries pendant l’infection. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente une méthode de surveillance de l’infection bactérienne et de l’administration de protéines effectrices dans les cellules végétales à l’aide de la complémentation de la protéine fluorescente verte superfolder (sfGFP) combinée à la microscopie confocale. L’approche permet une visualisation précise de la translocation de l’effecteur dans le cytosol de la cellule hôte.

Protocole

NOTE: Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Préparation du matériel végétal (4 semaines)

1. Préparation pour les plantes Nicotiana benthamiana
   1. Semez 2 graines de N. benthamiana à la surface du sol de chaque pot, couvrez le plateau d’un dôme en plastique et laissez les graines germer dans une chambre de croissance à 25 °C, 60 % d’humidité avec un cycle photopériodique clair/foncé de 16/8 h.
   2. Après deux semaines, choisissez et jetez le plus petit semis dans chaque pot. Continuez à cultiver les plantes dans les mêmes conditions de croissance que celles appliquées pour la germination à l’étape 1.1.1. Ajouter 1 L d’eau par plateau tous les deux jours.
      NOTE: Les conditions de croissance des plantes peuvent varier d’un laboratoire à l’autre. Par conséquent, suivez le protocole d’arrosage régulier pour faire pousser la plante dans un état sain.
   3. Dans une semaine, transférez les plantes dans un nouveau plateau et disposez-les avec suffisamment d’espace pour une croissance ultérieure. Continuez à cultiver les plantes dans les conditions décrites à l’étape 1.1.1 jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être infiltrées à l’âge de 4 semaines.
      NOTE: La croissance des plantes peut différer en fonction des conditions de croissance dans les laboratoires. Habituellement, nous constatons que les plantes de N. benthamiana , âgées de 4 semaines, portent environ six feuilles.
2. Préparation pour les plantes transgéniques d’Arabidopsis thaliana
   1. Reportez-vous à la table des matériaux et commandez les graines transgéniques d’Arabidopsis.
   2. Faites tremper ~50 à 100 graines transgéniques d’Arabidopsis dans 1 mL d’eau distillée et conservez-les à 4 °C pendant 3 jours dans l’obscurité pour synchroniser le début de la germination.
   3. Semez ~2 à 3 graines à la surface du sol d’un bac à plantes en motte et recouvrez le plateau d’un dôme en plastique. Laissez les graines germer à 23 °C, 60 % d’humidité avec un cycle photopériodique clair/foncé de 10/14 h.
      NOTE: Les graines doivent être homozygotes. Cependant, nous recommandons de reconfirmer la présence du transgène dans le lot. Dans ce cas, stérilisez les graines en les lavant avec de l’éthanol à 70 % pendant 2 min, de l’eau de Javel à 50 % (environ 2 % d’hypochlorite) contenant 0,05 % de Triton X-100 pendant 5 min. Suivi d’un lavage 5 à 6 fois avec de l’eau stérile doublement distillée (ddH₂O). Après la stérilisation, stratifier à 4 °C pendant 3 jours et les déposer sur un milieu de germination contenant 25 μg/L d’hygromycine B pour sélectionner les plantes transgéniques.
   4. Au bout d’une semaine, ne laissez qu’une seule plante par mottes et continuez à cultiver les plantes dans les mêmes conditions de croissance que celles utilisées pour l’étape 1.2.3.
      NOTE: Des plantes âgées de quatre semaines ont été utilisées pour l’infection à Pseudomonas syringae . Arrosez les plantes tous les deux jours pour les garder en bonne santé.

2. Préparation de la culture de Pseudomonas (~1 semaine)

1. Construction du plasmide pour la transformation de Pseudomonas
   1. Reportez-vous à la table des matériaux et commandez le(s) vecteur(s) souhaité(s) du vecteur de distribution effecteur basé sur le système de sécrétion de type III (T3SS).
   2. Insérez le gène effecteur d’intérêt dans le vecteur de livraison effecteur à l’aide du clonage de recombinaison spécifique au site.
      NOTE: Lors de la surveillance de la localisation subcellulaire de la protéine effectrice pleine longueur, placez le gène pleine longueur dans pBK-GW-1-2 ou pBG-GW-1-2. Il est également possible de choisir pBK-GW-1-4 ou pBG-GW-1-4 contenant 2x sfGFP11 (11e brin β de sfGFP) pour un signal de fluorescence accru. Dans le cas d’un effecteur partiel dépourvu de peptide de signal, utilisez pBK-GW-2-2 ou pBK-GW-2-4.
2. Transformer le plasmide porteur d’un effecteur fusionné à l’étiquette sfGFP11 en P. syringae pv. Tomate (Pst) CUCPB5500 par électroporation standard.
   NOTE: D’autres souches de Pseudomonas peuvent être utilisées si nécessaire. Le système de marquage sfGFP11 est conçu pour une large gamme de vecteurs, et l’expression génique de l’effecteur est régulée par le promoteur AvrRpm1, qui est comparable à, par exemple, Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. Répartissez doucement les cellules bactériennes transformées sur la surface des plaques de gélose B de King contenant 100 μg/mL de rifampicine et 25 μg/mL de kanamycine ou 25 μg/mL de gentamycine. Incuber à 28 °C pendant 2 jours.
4. Inoculer une colonie dans un milieu liquide King’s B avec des antibiotiques appropriés au vecteur utilisé, et faire pousser les cellules pendant la nuit à 28 °C en les secouant à 200 tr/min.
5. Faites un bouillon de glycérol. Ajouter le glycérol autoclavé à une concentration finale de 50 % et conserver à -80 °C.

3. Expression transitoire de sfGFP1-10^OPT ciblant les organites (1- 10^e brin β de sfGFP) chez N. benthamiana (4 jours)

1. Préparation de la culture d’Agrobacterium
   1. Commandez le(s) vecteur(s) souhaité(s) du ou des plasmides^OPT sfGFP1-10 ciblant les organites (reportez-vous à la Table des matériaux).
   2. Transformer le(s) plasmide(s) en cellules GV3101 de la souche d’Agrobacterium tumefaciens . Cultiver les cellules sur un milieu gélosé Luria-Bertani (LB) complété par 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine à 28 °C pendant 2 jours.
   3. À partir d’une seule colonie sur le milieu gélosé LB, inoculer les cellules dans 5 mL de milieu liquide LB complété par 50 μg/mL de kanamycine et 50 μg/mL de rifampicine. Faites pousser les cellules pendant la nuit à 28 °C en secouant à 200 tr/min.
   4. Récoltez les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. Videz le milieu surnageant et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon d’infiltration fraîchement préparé.
   5. Mesurer la quantité d’Agrobacterium en obtenant la valeur de densité optique (DO) à une absorbance de 600 nm (Abs 600 nm). Ajustez la DO₆₀₀ des bactéries à 0,5 avec tampon d’infiltration.
      REMARQUE : 1 mL de suspension suffit pour s’infiltrer sur deux points.
   6. Laissez la culture à température ambiante sur une bascule douce pendant 1 à 5 h avant l’infiltration.
   7. Percez un trou au centre des feuilles à infiltrer avec une pointe de 10 μL. À l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 ml, infiltrer les suspensions d’Agrobacterium . Injecter soigneusement et lentement environ 500 μL des suspensions préparées à l’étape 3.1.5 dans le côté adaxial de la feuille à l’aide de la seringue. Répétez l’infiltration sur au moins trois plantes différentes pour des répétitions expérimentales.
      NOTE: Pour des raisons de santé et de sécurité, des lunettes de protection doivent être portées lors de l’infiltration.
   8. Essuyez la suspension bactérienne restante sur les feuilles et marquez la limite de la région infiltrée.
   9. Conservez les plantes infiltrées dans les mêmes conditions de croissance que celles utilisées pour l’étape 1.1.1 pendant 2 jours.

4. Inoculation de Pseudomonas (4 jours)

1. Striez la souche transformée de Pseudomonas à partir du stock de glycérol à l’étape 2.5 sur un milieu de gélose King’s B avec les antibiotiques appropriés à 28 °C pendant 2 jours.
   NOTE: La santé de Pseudomonas est très critique. Si les colonies ne se forment pas bien, striez à nouveau les cellules ou propagez les cellules dans le milieu liquide du roi avant de continuer.
2. Inoculez une boucle de cellules Pseudomonas dans un milieu liquide Mannitol-Glutamate (MG) à 28 °C avec agitation à 200 tr/min pendant la nuit.
3. Récoltez les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. Videz le milieu surnageant, remettez la pastille en suspension dans 10 mM de MgCl₂ et ajustez la DO₆₀₀ à 0,02 (1 x 10⁷ ufc/mL) pour les feuilles de N. benthamiana et à 0,002 (1 x 10⁶ ufc/mL) pour les feuilles d’Arabidopsis.
4. Dans le cas de N. benthamiana, infiltrez la suspension de Pseudomonas dans la zone des feuilles où la construction^OPT d’Agrobacterium portant sfGFP1-10 a été infiltrée 2 jours auparavant (comme à l’étape 3.1.7). Pour l’Arabidopsis transgénique sfGFP1-10^OPT, infiltrez la suspension de Pseudomonas dans deux feuilles courtes de 4 semaines cultivées à la journée.
   NOTE: Au moins trois plantes sont nécessaires pour les répliques expérimentales.

5. Observation du signal sfGFP par microscopie confocale (1 jour)

1. Découpez le disque foliaire des feuilles inoculées à Pseudomonas. À des moments précis après l’infiltration de Pseudomonas, imagez deux disques foliaires de 2 cm de^la plante à l’aide d’un système confocal à balayage laser avec un objectif d’immersion dans l’eau C-Apochromat à ouverture numérique (NA) de 40X/1,2 ou un objectif d’immersion dans l’huile C-Apochromat de 63X/0,8 NA. Pour éviter les cellules mortes tuées par les blessures, observez les cellules loin du trou d’infiltration.
2. Démarrez l’observation à une puissance faible du laser à argon de 488 nm. Augmentez la puissance du laser pour détecter sfGFP.
   NOTE: Nous utilisons généralement 2 à 15 % de l’intensité du laser pour détecter le signal de fluorescence. Cependant, la puissance et les paramètres de détection du laser doivent être ajustés en fonction du système de microscopie de l’utilisateur. Ici, les filtres d’émission ont été réglés sur 520 - 550 nm. Les cellules mortes émettent souvent une auto-fluorescence sous l’excitation laser de 488 nm. Par conséquent, en tant que contrôle négatif, le même effecteur sans l’étiquette sfGFP11 doit être infiltré et observé dans les mêmes conditions d’observation. De plus, une excitation laser élevée peut induire l’autofluorescence de la chlorophylle. Par conséquent, ajustez l’intensité du laser à l’aide des cellules végétales de contrôle afin de ne pas induire l’autofluorescence de la chlorophylle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignées transgéniques d’Arabidopsis			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Plasmide sfGFP1-10OPT ciblant les organites			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfCerise1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
Vecteur compatible avec la passerelle balisée sfGFP11 pour le système de livraison effecteur basé sur T3SS	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Surveillance spatio-temporelle des effecteurs de Pseudomonas syringae via la sécrétion de type III à l’aide de fragments de protéines fluorescentes divisées. Cellule végétale. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1 :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1 :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la kanamycine (25 μg/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1 :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1 :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-sfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1 :AvrRPM1sp :GW :HA-2xsfGFP11 :AvrRpm1t ; Résistant à la gentamycine (25 μg/ml)
Souches bactériennes
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz et Jeff Schell, le promoteur du gène 5 de l’ADN-TL contrôle l’expression tissulaire spécifique des gènes chimères portés par un nouveau type de vecteur binaire Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Résistant à la gentamycine (50 μg/ml) et à la rifampicine (50 μg/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomate CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Délétions dans le répertoire de Pseudomonas syringae pv. Les gènes effecteurs de sécrétion de la tomate DC3000 de type III révèlent un chevauchement fonctionnel entre les effecteurs. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Résistant à la rifampicine (100 μg/ml)
Composants multimédias
Milieu de germination des plantes			Ajouter 2,165 g/L de poudre Murashige & Skoog, 10 g/L de saccharose à l’eau. Ajuster au pH 5,8 et ajouter 2,2 g/L de phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium avec vitamines	Duchefa Biochimie	Référence M0222	Conserver à 4 °C.
Saccharose	Duchefa Biochimie	Réf. S0809
Le phytagel	Sigma-Aldrich	Réf. P8169
Médias LB			Ajouter 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl à l’eau. Pour les milieux solides, ajouter 15 g/L de micro-agar. Autoclave. Laissez la solution refroidir à 55 °C et ajoutez un antibiotique si nécessaire.
Tryptone	BD Biosciences	211705
Extrait de levure	BD Biosciences	212750
NaCl	Duchefa Biochimie	Réf. S0520
Micro gélose	Duchefa Biochimie	M1002
Médias du roi B			10 g/L de protéase peptone #2, 1,5 g/L de K2anhydre HPO4, 15 g/L de gélose à l’eau. Autoclave. Refroidir à 55 °C et ajouter 15 ml/L de glycérol stérile et 5 ml/L de MgSO4 au milieu. Ajoutez des antibiotiques si nécessaire.
Peptone protéose	BD Biosciences	212120
Anhydre K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 USP
Glycérol	Duchefa Biochimie	G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	Référence M7506
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
Milieux liquides Mannitol-Glutamate (MG)			Ajouter 10 g/L de mannitol, 2 g/L d’acide L-glutamique, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl et 0,2 g/L de MgSO4 à l’eau. Ajuster au pH 7
Mannitol	Duchefa Biochimie	Référence M0803
Acide L-glutamique	Duchefa Biochimie	G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Tampon d’infiltration			10 mM de MES (acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique), 10 mM de MgCl2, 150 μM d’acétosyringone. pH 5,6 ; Préparez un tampon frais avant utilisation.
MES	Duchefa Biochimie	M1503	Préparez 100 mM (pH 5,6) de bouillon dans de l’eau. Filtrer la stérilisation.
MgCl2	Sigma-Aldrich	Référence M8266	Préparez 100 mM de bouillon dans l’eau. Autoclave.
Acétosyringone	Sigma-Aldrich	D134406	Préparez 150 mM de stock dans du DMSO.
Equipements/matériaux pour microscopes confocaux
Système confocal à balayage laser 710	Carl Zeiss
Microscope inversé Axio observer Z1	Carl Zeiss