Isolement ciblé de colonies bactériennes à l’aide de la dégradation d’hydrogel à motifs légers

Abstract

Source : Fattahi, N., et al. Interfaces hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre l’extraction de colonies bactériennes à partir d’un hydrogel photodégradable à l’aide de la lumière UV. Une colonie spécifique est sélectionnée et une exposition à la lumière structurée est conçue pour initier la dégradation localisée de l’hydrogel. Après avoir ajusté l’intensité et la durée de la lumière, la lumière UV est appliquée, libérant la colonie. La colonie est ensuite aspirée à travers un tube et transférée dans un tube pour une analyse en aval.

Protocol

1. Souches bactériennes et protocoles de culture

1. Striez les colonies de bactéries sur des plaques de gélose complétées par des milieux de croissance appropriés. Dans ce rapport, B. subtilis (souche 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) est cultivé sur ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (dihydrogénophosphate de potassium), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (sulfate d’ammonium), 0,6 mM MgSO₄·7H₂O (sulfate de magnésium heptahydraté), 0,06 mM CaCl₂·2H₂O (chlorure de calcium dihydraté), 0,0071 mM MnSO₄·H₂O (sulfate de manganèse (II) monohydraté), 0,125 M FeSO₄·7H₂O (sulfate ferreux heptahydraté), 28 mM de glucose, pH : 7 ± 0,2, 15 g/L de gélose) sur des plaques de gélose de 100 μg/mL de spectinomycine et d’E. coli (souche 25922, ATCC) sur des plaques de gélose ATGN complétées par 100 μg/mL d’ampicilline.
   REMARQUE : Des rapports antérieurs d’encapsulation et de libération d’hydrogel avec ces matériaux utilisaient des cellules A . tumefaciens C58
2. Choisissez les colonies souhaitées dans les plaques de gélose ATGN et commencez les cultures pendant la nuit. Pour les souches d’E. coli et de B. subtilis utilisées ici, cultiver à 37 °C en agitant à 215 tr/min dans un milieu liquide ATGN pendant 24 h. Conservez les cultures cellulaires dans du glycérol à 50 % à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
3. Prélever des colonies des deux souches dans les stocks de glycérol à l’aide de boucles d’inoculation stériles et incuber dans un milieu liquide ATGN pendant 24 h à 37 °C et 215 tr/min.

2. Préparation du matériau nécessaire à la formation de l’hydrogel

1. Synthèse photodégradable de PEG-o-NB-diacrylate (poly(éthylène glycol)-ortho-nitrobenzyl-diacrylate)
   REMARQUE : La synthèse interne du diacrylate PEG-o-NB a été bien décrite et déjà rapportée. Alternativement, comme la synthèse est de routine, elle peut être externalisée à partir d’une installation de synthèse chimique.
2. Tampon de réticulation
   1. Prenez la recette du milieu sélectionné pour la souche bactérienne et préparez le milieu avec 2x nutriments. Ajouter du phosphate, par exemple NaH₂PO₄ (dihydrogénophosphate de sodium), au milieu jusqu’à une concentration finale de 100 mM. Ensuite, ajustez la valeur du pH à 8 en utilisant 5 M de NaOH (hydroxyde de sodium) (aqueux).
   2. Stérilisez la solution tampon et conservez-la à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement.
      REMARQUE : Laissez de côté les métaux de transition présents dans les milieux, car ces métaux catalysent l’oxydation des thiols en disulfures.
3. Solution de diacrylate de PEG-o-NB
   1. Pour chaque mg de poudre aliquote de diacrylate de PEG-o-NB (poids moléculaire de 3 400 Da), ajouter 3,08 μL d’eau ultrapure pour atteindre une concentration de 49 mM de diacrylate de PEG-o-NB (concentration d’acrylate de 98 mM).
   2. Agitez la solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée et conservez cette solution à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement.
4. Solution PEG-thiol à 4 bras
   1. Pour une préparation de PEG-thiol (poids moléculaire de 10 000 Da à 4 bras), ajouter 4 μL d’eau ultrapure par mg de poudre pour atteindre une concentration de 20 mM (80 mM de concentration en thiol).
   2. Vortex cette solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée et conservez-la à -20 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à nouveau.

3. Préparation de lamelles perfluoroalkylées (non réactives)

1. Placez jusqu’à 5 lames de verre (25 mm x 75 mm x 1 mm) à l’intérieur d’une enveloppe de lames en polypropylène. Sonicer les lames avec une solution détergente à 2 % (p/v) (tableau des matériaux) pendant 20 min.
2. Rincez les lames trois fois à l’eau ultra-pure, puis sonicez les lames dans l’eau pendant 20 min. Séchez les lames à l’aide d’un jet de N₂ (azote).
3. Nettoyez au plasma (voir le tableau des matériaux) des deux côtés des lames de verre conformément au protocole de la section 4.1 pendant 2 min.
4. Remettez les lames nettoyées au plasma dans l’enveloppe de lames et remplissez le récipient avec une solution à 0,5 % (v/v) de trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctyl)silane dans du toluène. Permettez à ces lames de verre d’être fonctionnalisées pendant 3 h à température ambiante (RT).
5. Une fois les lames fonctionnalisées, rincez-les à l’intérieur de l’enveloppe de lames, d’abord avec du toluène, puis de l’éthanol (trois fois avec chaque solvant). Ensuite, séchez chaque lame fonctionnalisée avec un jet de N₂.

4. Préparation de lamelles (base) fonctionnalisées au thiol

1. Nettoyage des lamelles en verre à l’aide d’un nettoyeur plasma
   1. Placez les lamelles de 18 mm x 18 mm dans une boîte de Pétri. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans une chambre de nettoyage plasma et allumez la puissance du nettoyeur plasma.
   2. Allumez la pompe à vide pour évacuer l’air à l’intérieur de la chambre jusqu’à ce que le manomètre indique 400 mTorr.
   3. Ouvrez la vanne de dosage pour laisser entrer l’air dans la chambre jusqu’à ce que le manomètre atteigne une pression constante (800-1000 mTorr). Ensuite, sélectionnez RF avec le mode « Hi » et exposez les lamelles pendant 3 minutes.
   4. Après 3 minutes, désactivez le mode RF et la pompe à vide.
   5. Sortez la boîte de Pétri de la chambre, retournez les lamelles, remettez-les dans la chambre au plasma et exposez l’autre côté de la lamelle en verre.
   6. Répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.4 pour nettoyer au plasma le côté non traité de la lamelle en verre.
   7. Une fois le processus terminé, retirez la boîte de Pétri de la chambre et éteignez le nettoyeur de plasma et la pompe à vide.
2. Nettoyage et hydroxylation des lamelles avec une solution de piranha
   REMARQUE : Les protocoles standard de nettoyage des piranhas peuvent être utilisés pour nettoyer et hydroxyler les lames de verre. La solution de piranha est un mélange 30:70 (v/v) de H₂O₂ (peroxyde d’hydrogène) et de H₂SO₄ (acide sulfurique). D’autres méthodes de nettoyage des lamelles en verre peuvent également être utilisées.
   ATTENTION : La solution de piranha est fortement corrosive et explosive avec des solvants organiques et doit être manipulée avec une extrême prudence. Des mesures de sécurité et de confinement appropriées doivent être mises en œuvre, telles que l’utilisation d’un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, tablier résistant aux produits chimiques, lunettes de sécurité, écran facial, gants en butyle résistant aux acides). Toute la verrerie et les surfaces de travail en contact avec la solution de piranha doivent être propres, sèches et exemptes de résidus organiques avant utilisation. La solution de piranha ne doit jamais être conservée dans un récipient partiellement fermé ou fermé.
   1. Placez un plat en verre propre de 100 mm x 50 mm sur un agitateur magnétique à plaque chauffante avec vitesse d’agitation réglable sous une hotte et ajoutez 14 ml de H₂SO₄ dans le plat.
   2. Placez délicatement une petite barre d’agitation magnétique recouverte de téflon à l’aide d’une pince recouverte de téflon à l’intérieur du plat. Ensuite, tournez lentement l’agitateur pour éviter d’éclabousser l’acide.
   3. Ensuite, ajoutez délicatement 6 ml de H₂O₂ dans le plat et laissez la solution bien mélanger.
   4. Éteignez l’agitateur, puis retirez la barre d’agitation du plat à l’aide de la pince. Ensuite, placez délicatement les lamelles à l’intérieur du plat à l’aide de la pince et réglez la température sur 60-80 °C.
   5. Après 30 min, retirez délicatement les lamelles à l’aide de la pince et plongez-les deux fois dans de l’eau déminéralisée (DI) pour éliminer la solution résiduelle de piranha.
   6. Après le rinçage à l’eau, conservez les lamelles dans de l’eau DI à RT jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement.
   7. Éteignez la plaque chauffante et laissez refroidir la solution de piranha.
   8. Pour éliminer la solution de piranha, placez délicatement le plat en verre de 100 mm x 50 mm contenant la solution de piranha refroidie dans un bécher en verre plus grand et vide d’un volume d’au moins 1,5 L. Ajoutez ensuite 1 L d’eau à diluer et ajoutez de la poudre de bicarbonate de sodium pour neutraliser. Notez que le bicarbonate de sodium provoquera des bulles et une génération de chaleur et doit être ajouté très lentement ; Sinon, des bulles peuvent entraîner des éclaboussures d’acide. Lorsque l’ajout supplémentaire de bicarbonate de sodium ne provoque pas de bulles, vérifiez le pH avec du papier pH pour vérifier qu’il a été neutralisé. Une fois la solution neutralisée et refroidie, elle peut être versée dans l’évier.
3. Fonctionnalisation thiol des lamelles
   1. Préparer une solution à 5 % (v/v) de 269 mM de triméthoxysilane (3-mercaptopropyl) solution de triméthoxysilane (MPTS) dans du toluène sec.
   2. Ajouter 10 ml de la solution dans des tubes à centrifuger coniques individuels de 50 ml. Placez une lamelle nettoyée dans chaque tube et immergez-la dans la solution.
      REMARQUE : Une lamelle par tube de 50 mL est utilisée pour assurer la thiolation des deux côtés du substrat sans être perturbé par d’autres substrats.
   3. Après 4 h, laver chaque lamelle (quatre lavages par lamelle) avec du toluène, un mélange éthanol-toluène 1:1 (v/v) et de l’éthanol.
      REMARQUE : Cela se fait en immergeant séquentiellement chaque lamelle dans des tubes à centrifuger coniques contenant les solutions mentionnées.
   4. Après avoir rincé le support, immergez-le dans de l’éthanol et stockez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
      REMARQUE : Selon le nombre de lamelles, cette méthode peut devenir laborieuse en raison du traitement des lamelles une par une. Pour plusieurs lamelles, il est possible d’utiliser des bocaux Columbia qui s’adaptent à plusieurs lamelles en même temps.

5. Fabrication de réseaux de micropuits en silicium

1. Revêtement en parylène : Utilisez le protocole standard décrit dans des articles de recherche précédents pour enrober les plaquettes de silicium de parylène.
2. Microfabrication : Suivre le protocole décrit par Barua et al. pour concevoir et fabriquer le réseau de micropuits. ​

6. Formation d’hydrogel

1. Formation d’hydrogel en vrac sur lamelles en verre
   1. Solution de précurseur d’hydrogel : Ajouter 12,5 μL du tampon de réticulation dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL, suivi de 5,6 μL de solution de diacrylate de PEG-o-NB. Enfin, ajoutez 6,9 μL de solution de PEG-thiol à 4 bras au mélange.
      REMARQUE : L’ajout du thiol PEG à 4 bras au mélange déclenche la réaction de réticulation. Ainsi, la solution de précurseur d’hydrogel doit être utilisée immédiatement après le mélange.
   2. Pour l’encapsulation des cellules dans la solution de précurseur d’hydrogel, suivez les étapes 6.1.3 à 6.1.9.
   3. Pour l’encapsulation de cellules, avant l’étape 6.1.1, inoculez le tampon de réticulation avec la densité cellulaire souhaitée. Comme indiqué précédemment19, il a été observé qu’une densité cellulaire de 7,26 × 10⁷ UFC/mL dans le tampon de réticulation est corrélée à une densité de ~ 90 cellules/^mm2 encapsulées dans l’hydrogel.
   4. Placez la lamelle de base thiolée sur une boîte de Pétri propre. Placez deux entretoises (voir la table des matériaux) sur les deux côtés opposés de la lamelle.
      REMARQUE : La fonctionnalisation thiol des lamelles est nécessaire pour la fixation covalente de l’hydrogel à la surface de la lamelle. Cela se fait par la réaction des groupes thiols à la surface et des groupes acrylate présents dans la solution de précurseur de l’hydrogel.
   5. Fixez les entretoises sur la lamelle de base en collant les entretoises sur la boîte de Pétri.
   6. Pipeter le volume souhaité de la solution précurseur sur une lame de verre perfluoroalkylée non réactive.
   7. Placez la lame de verre perfluoroalkylé sur la lamelle de base (Figure 1C). Attendez 25 minutes à RT pour que la formation de l’hydrogel soit terminée.
   8. Après la gélification, retirez délicatement la lame de verre perfluoroalkylé. L’hydrogel restera attaché à la lamelle de base. ​
      REMARQUE : Pour que les lamelles de recouvrement de 18 mm x 8 mm obtiennent une membrane de 12,7 μm d’épaisseur, utiliser ~7 μL de la solution de précurseur (Figure 1A, B). L’utilisation de volumes plus élevés de solution de précurseur peut entraîner la formation d’un hydrogel sous la lamelle de base. Cela peut faire en sorte que la lamelle de base adhère à la boîte de Pétri et se brise lors d’une tentative de retrait. De plus, les résidus d’hydrogel sous la lamelle sont problématiques pour la microscopie. Il est nécessaire d’enlever en douceur la lame de verre perfluoroalkylé non réactive, car un retrait rapide peut endommager l’hydrogel.
   9. Placez le substrat dans une boîte de Pétri de 60 mm x 15 mm dans le milieu de culture spécifié. Ici, un milieu ATGN complété par 100 μg/mL de spectinomycine pour B. subtilis ou 100 μg/mL d’ampicilline pour E. coli à 37 °C a été utilisé pendant 24 heures de culture.

7. Préparation du matériel pour l’extraction cellulaire

1. Préparation du support PDMS (polydiméthylsiloxane)
   1. Collez ensemble une pile de dix lamelles de 18 x 18 mm et collez cette pile de lamelles au fond d’une boîte de Pétri.
   2. Pour fabriquer des supports PDMS, mélangez le précurseur PDMS et l’agent de durcissement à un rapport de volume de 10:1 dans un gobelet en plastique, dégazez le mélange dans un dessiccateur sous vide, puis versez le mélange dans la boîte de Pétri.
   3. Durcir le PDMS pendant 90 min à 80 °C. Ensuite, coupez autour du bloc scotché pour retirer le support PDMS et placez le support PDMS sur une lame de verre pour faciliter la manipulation pour la microscopie.
2. Préparation de la microseringue et de la tubulure
   1. Coupez 20 cm de tube en PTFE (polytétrafluoroéthylène) (0,05 po de diamètre intérieur) et fixez une extrémité du tube à une seringue de 100 μL de microlitre.
      REMARQUE : Pour l’extraction, évitez d’utiliser des pipettes car le prélèvement des cellules libérées à l’aide d’une pointe de pipette peut endommager la surface de l’hydrogel et entraîner une contamination.

8. Dégradation de l’hydrogel avec l’outil d’éclairage à motifs

1. Allumez le microscope (voir Tableau des matériaux). Ensuite, activez l’outil d’éclairage à motifs (voir Table des matériaux).
2. Allumez la source lumineuse LED 365 nm Module de commande analogique et numérique. Ensuite, allumez le module de contrôle de la source lumineuse LED.
3. Ouvrez le logiciel du microscope et le logiciel de l’outil d’éclairage à motifs. Lorsque la fenêtre de configuration matérielle s’ouvre, sélectionnez le bouton Charger.
   REMARQUE : Trois appareils seront chargés ici. (Caméra tierce, module de commande et outil d’éclairage à motifs)
4. Appuyez sur le bouton Démarrer. La fenêtre du logiciel de motif de lumière s’ouvre maintenant. Sélectionnez la première option, le bouton Contrôle de l’appareil, dans la barre latérale gauche de la fenêtre.
5. Calibrez l’outil d’éclairage à motifs.
   REMARQUE : L’étalonnage doit être effectué avec le même objectif de microscope et le même filtre que ceux qui seront utilisés pour l’exposition à la lumière.
   1. Réglez l’objectif du microscope sur un grossissement de 10x.
      REMARQUE : Ce grossissement permet une distance de travail suffisante entre l’objectif du microscope et la surface de l’échantillon. Il permet également de surveiller et d’enregistrer le processus de récupération en temps réel via la fenêtre d’image.
   2. Réglez l’objectif et le filtre du microscope sur les paramètres utilisés pour l’exposition à la lumière et placez le miroir d’étalonnage sous le microscope.
   3. Dans la fenêtre Contrôle de périphérique, appuyez sur l’onglet Contrôle LED. Allumez la LED #1 et réglez l’intensité lumineuse sur le nombre souhaité. Dans les expériences d’extraction standard, ce taux est fixé à 60 %.
   4. Appuyez sur l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs dans la fenêtre de contrôle du périphérique. Appuyez ensuite sur le bouton Afficher la grille.
      REMARQUE : Un motif de grille sera projeté sur le miroir d’étalonnage.
   5. Ajustez la mise au point du microscope et l’exposition de la caméra pour obtenir une qualité d’image élevée de la grille et faites pivoter la caméra pour aligner les lignes de la grille parallèlement au cadre de la fenêtre de la caméra, si nécessaire.
   6. Sélectionnez le bouton Assistant d’étalonnage sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs et suivez les instructions fournies par le logiciel dans cette fenêtre. REMARQUE : Une fenêtre de configuration de l’appareil photo tiers s’ouvrira.
   7. Une fenêtre de sélection du type d’étalonnage s’ouvrira. Sélectionnez Étalonnage automatique et appuyez sur Suivant.
   8. Lorsque la fenêtre de réglage du pré-étalonnage s’ouvre, suivez les instructions du logiciel et appuyez sur le bouton Suivant.
   9. Lorsque la fenêtre Informations de mappage s’ouvre, enregistrez cet étalonnage en conséquence dans le dossier souhaité. Pour ce faire, il suffit d’entrer la date, le nom du microscope, l’objectif, l’objectif et le filtre.
   10. Après l’étalonnage, appuyez sur le bouton Définition de la zone de travail situé sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs pour définir la zone de travail de l’outil d’éclairage à motifs si nécessaire.
6. Section de conception de séquence pour la préparation des motifs.
   1. Appuyez sur le bouton Conception de séquence dans la barre latérale gauche de la fenêtre du logiciel. Appuyez ensuite sur le bouton Éditeur de séquence de profils.
   2. Lorsque la fenêtre Éditeur de séquence de profils s’ouvre, sélectionnez l’option Nouveau profil sous la liste des profils.
      REMARQUE : Maintenant, une fenêtre d’éditeur de motifs sera ouverte.
   3. Préparez le motif souhaité pour l’exposition à la lumière en choisissant différentes formes et tailles de motif ou en dessinant manuellement le motif, si vous le souhaitez.
   4. Pour les motifs circulaires et croisés brisés pour l’hydrogel en vrac, suivez les étapes 8.6.5 à 8.6.6
   5. Pour les motifs circulaires, définissez un cercle de 30 μm de diamètre au-dessus d’une colonie bactérienne cible pour couvrir l’ensemble de la colonie. Choisissez la couleur de remplissage de la forme blanche.
   6. Pour les motifs en croix brisée, choisissez la forme rectangulaire dans la fenêtre de dessin du motif avec des dimensions de 3 μm x 8 μm. Placez quatre rectangles de ces dimensions sur les bords de la colonie cible, tandis que la moitié des motifs ont une superposition avec la colonie.
   7. Pour les motifs circulaires et annulaires pour les réseaux de micropuits, suivez les étapes 8.6.8 à 8.6.10.
   8. Pour les motifs circulaires, tracez un cercle de 10 m de diamètre autour du périmètre du puits. Choisissez la couleur de remplissage de la forme blanche.
   9. Pour le motif de l’anneau, dessinez un cercle de 20 μm de diamètre, placez-le sur le puits et choisissez la couleur de remplissage de la forme blanche.
   10. Dessinez un autre motif circulaire de diamètre 10 μm avec une forme de remplissage de couleur noire et placez-le autour du périmètre du puits.
7. Modifiez le motif et modifiez les formes en fonction de la méthode d’extraction souhaitée. Assurez-vous que le motif souhaité existe dans la zone de travail de l’outil d’éclairage à motifs.
8. Placez l’échantillon dans un support PDMS et pipetez le milieu défini sur l’échantillon pour éviter la déshydratation de l’échantillon et fournir une solution de support pour les cellules libérées.
9. Ensuite, remplacez-le par le miroir d’étalonnage.
10. Ajustez la mise au point du microscope pour obtenir une image nette des colonies à l’intérieur de l’hydrogel. Inspectez les colonies pour identifier une colonie d’intérêt.
11. Ici, concevez les motifs lumineux tandis que la vue de la caméra montre les colonies à l’intérieur de l’échantillon pour tester différents motifs pour l’extraction des cellules.
12. Enregistrez le motif défini. Après avoir enregistré le modèle défini, sélectionnez la section Contrôle de session.
13. Dans cette section, sous l’onglet intitulé avec le nom du produit de l’outil d’éclairage à motifs, ajoutez la séquence enregistrée.
14. Après avoir ajouté la séquence, choisissez l’option permettant de simuler le motif à afficher et à ajuster pour l’emplacement d’exposition souhaité.
    REMARQUE : L’emplacement de l’échantillon peut être ajusté ici pour s’assurer que le motif est projeté avec précision dans la zone ciblée.
15. Ensuite, réglez l’intensité lumineuse à 60 % et le temps d’exposition à 40 s sous l’onglet de commande LED et lancez le processus d’exposition.
16. Surveillez la dégradation de l’hydrogel en temps réel et en mode fond clair pour assurer la libération des cellules.
    REMARQUE : Évitez tout mouvement de l’échantillon pendant l’exposition à la lumière, car cela peut entraîner une dégradation des zones indésirables de l’hydrogel, entraînant une contamination croisée.

9. Récupération de cellules

1. Après une exposition à la lumière de 365 nm et la libération des cellules, les cellules sont collectées à l’aide d’une seringue d’un microlitre et d’un tube microfluidique (Figure 2).
   REMARQUE : La récupération des cellules doit être effectuée immédiatement après l’exposition du motif. Cela permet une récupération cellulaire localisée avant que les cellules libérées ne s’éloignent de la zone irradiée.
2. Changez le microscope de fond clair à filtre FITC ou TRITC pour permettre de visualiser la zone exposée de l’échantillon à l’œil nu.
3. Une fois la zone exposée localisée, placez l’extrémité du tube sur le point irradié. Ensuite, remettez le filtre du microscope en fond clair pour surveiller la récupération des cellules en temps réel.
4. Utilisez la seringue fixée à l’autre extrémité du tube pour prélever soigneusement les cellules libérées. Prélever 200 μL de la solution et l’insérer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL pour l’analyse de l’ADN ou le placage.

Results

Figure 1 : Formation d’hydrogel sur des lamelles en verre thiolé. (A) Des entretoises d’une épaisseur de 12,7 μm sont placées sur deux côtés opposés d’une lamelle de base contenant des groupes thiols réactifs. (B) La solution de précurseur d...

Materials