Quantification de l’alginate bactérien à l’aide du dosage du carbazole d’acide uronique

Résumé

Source : Al Ahmar, R., et al. Culture d’une variante en petite colonie de Pseudomonas aeruginosa et quantification de son alginate. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente un test colorimétrique pour quantifier l’alginate produit par Pseudomonas aeruginosa, en utilisant le carbazole pour détecter les acides uroniques après hydrolyse acide. La méthode permet une analyse comparative de la production d’alginate normalisée à la biomasse bactérienne dans la recherche et les études cliniques.

Protocole

1. Dosage du carbazole d’acide uronique

1. Identifier une seule colonie à partir d’une culture pure de la souche souhaitée à tester. À l’aide d’un cure-dent stérile, prélevez la colonie et placez-le dans un tube à essai de culture contenant 5 ml de bouillon d’isolement (PIB) de Pseudomonas . Cultiver dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h.
   NOTE: Les souches suivantes, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB et PAO581pyrD, ont été cultivées sur des plaques PIA (Pseudomonas isolation agar) ou sur des plaques PIA complétées par 0,1 mM d’uracile pour récolter l’alginate à des fins de mesure.
2. Sur une plaque PIA préchauffée, ajoutez 150 μL de bouillon PIB de culture (pour les plaques de 15 mm x 100 mm) ou 450 μL de bouillon (pour les plaques de 15 mm x 150 mm). À l’aide d’un épandeur de cellules stériles, étalez le bouillon sur la plaque. Cultivez la plaque à 37 °C pendant 24 h.
   NOTE: Aspirez tout excès de liquide, le cas échéant, de la plaque à l’aide d’une pipette en inclinant la plaque d’un côté. Les plaques PIB et PIA utilisées dans le protocole contiennent 20 ml/L de glycérol, que les cellules utilisent comme source de carbone pour aider à la production d’alginate.
3. À l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette stérile de 50 ml, ajoutez 0,85 % de NaCl (chlorure de sodium) à la pelouse cultivée et prélevez l’échantillon en raclant la plaque à l’aide d’un épandeur de cellules. Aspirer l’échantillon à l’aide d’une pipette fraîche de 50 mL dans un tube de prélèvement de 50 mL. Vortex l’échantillon à puissance élevée pour mélanger et placer les échantillons sur de la glace.
   NOTE: Le volume de NaCl ajouté à 0,85 % varie en fonction de la taille de la plaque. Pour les plaques de 15 mm x 100 mm, utilisez 10 à 30 ml, et pour les plaques de 15 mm x 150 mm, utilisez 20 à 50 ml.
4. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) des échantillons en ajoutant 1 mL de l’échantillon dans une cuvette jetable et en lisant la DO à l’aide d’un spectrophotomètre. Répétez cette étape 2 fois pour obtenir un triplé de lectures pour chaque échantillon.
5. Ajoutez 3 ml de la solution d’acide sulfurique/borate dans les tubes de culture et laissez-le reposer sur de la glace. Ajouter lentement 350 μL de l’échantillon prélevé au mélange d’acide dans les tubes à essai et agiter brièvement à intensité de vortex.
   1. Préparez le bouillon de borate en ajoutant 10,099 g de poudre d’hydroxyde de potassium (KOH) à 45 ml d’eau. Ajouter 24,74 g d’acide borique (H₃BO₃) au mélange et porter le volume à 100 mL.
   2. Placez une bouteille de 1 L dans un évier avec de la glace et remplissez-la de 500 mL d’acide sulfurique concentré. Ajouter LENTEMENT 15 ml du bouillon de borate préparé. Laissez refroidir la bouteille.
   3. Ajouter 10 ml de bouillon de borate pour un total de 25 ml. Une fois la bouteille refroidie, porter le volume à 1 L.
      PRUDENCE: Cette méthode repose sur l’utilisation d’acide sulfurique hautement concentré. Un équipement de protection individuelle approprié doit être utilisé pour assurer la sécurité, et le protocole d’élimination approprié de l’échantillon doit être suivi.
      NOTE: Pour un contrôle positif, une concentration connue d’acide D-mannuronique et/ou un échantillon d’alginate bactérien connu est récolté et purifié à l’aide de souches productrices d’alginates de P. aeruginosa (p. ex., PAO581-PAO1mucA25). Pour un contrôle négatif, utilisez une solution de NaCl à 0,85 % et/ou del’algD PAO1Δ (délétion dans le cadre du gène algD qui rend la bactérie complètement incapable de produire de l’alginate). Plusieurs tubes peuvent être fabriqués à partir de chaque échantillon pour augmenter le nombre de répétitions techniques afin de faciliter l’analyse statistique. Préparez 3 à 5 tubes de chaque échantillon.
6. Ajouter 100 μL de carbazole à 0,1 % dans une solution d’éthanol au mélange acide/échantillon. Boucher le tube et le vortex à réglage moyen pendant 5 s. Placer dans un bain sec à 55 °C pendant 30 min.
7. Après l’incubation, retirez brièvement les tubes et le vortex à puissance élevée et laissez refroidir pendant 5 min.
   NOTE: La couleur à voir serait une nuance de violet. La couleur restera stable pour la mesure pendant 1 à 2 h.
8. Lire la DO₅₃₀ de chaque tube en ajoutant 1 mL du mélange dans une cuvette propre et en lisant la DO des échantillons à 530 nm sur un spectrophotomètre. Utilisez le tube avec 0,85 % de NaCl comme blanc dans le spectrophotomètre.
9. Préparez une courbe standard en mesurant la DO₅₃₀ des dilutions en série de concentrations connues d’acide D-mannuronique (1 024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL et 8 μg/mL). Répétez l’opération 2 fois. Extrayez une équation linéaire à partir de ces lectures.
   NOTE: La courbe standard n’a besoin d’être effectuée qu’une seule fois. L’équation linéaire qui en est extraite peut être utilisée pour des tests ultérieurs.
   1. Calculez la concentration d’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et divisez la concentration d’alginate de l’équation linéaire par DO₆₀₀ pour obtenir la quantité totale d’alginate par DO₆₀₀.

Matériaux