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1. ELISA pour la quantification de l’alginate
1. À l’aide d’une micropipette, ajouter 50 μL de l’échantillon prélevé dans une plaque non traitée de 96 puits. Ajouter 50 μL de tampon d’enrobage (tampon carbonate/bicarbonate pH 9,6) dans les puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h.
NOTE: Pour un contrôle positif, une concentration connue d’acide D-mannuronique et/ou une souche stable productrice d’alginate connue (par exemple PAO581- PAO1mucA25) peut être utilisée. Pour un contrôle négatif, utilisez une solution de NaCl à 0,85 % et/ou de PAO1ΔalgD (la délétion dans le cadre du gène algD rend la bactérie complètement incapable de produire d’alginate). Plusieurs puits peuvent être construits à partir de chaque échantillon pour augmenter le nombre de répétitions techniques afin de faciliter l’analyse statistique. Préparez 3 à 5 puits de chaque échantillon.
2. À l’aide d’une bouteille à gicler, lavez les puits de l’assiette 2x avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,05 % Tween 20 (PBS-T) en remplissant les puits, puis égouttez-les en retournant l’assiette.
3. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 200 μL de tampon de blocage (10 % de lait écrémé dans le PBS-T) dans les puits. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
NOTE: Enveloppez la plaque dans un film de paraffine ou un film rétractable pour éviter toute évaporation dans le réfrigérateur.
4. À l’aide d’une bouteille à eau, lavez les puits de l’assiette 2 fois avec du PBS-T en remplissant les puits, puis en les égouttant en retournant l’assiette.
5. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 μL d’anticorps primaire dilué (anticorps monoclonal anti-alginate de souris) dans les puits et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 h.
NOTE: L’anticorps primaire (anticorps monoclonal anti-alginate de souris) a été fourni à une concentration de 0,5 μg/mL (dilution de 1:2 000 de 1 mg/mL de stock) dans une solution de diluant d’anticorps (1 % de lait écrémé dans 1 x PBS).
6. À l’aide d’une bouteille à eau, lavez les puits de l’assiette 3 fois avec du PBS-T en remplissant les puits, puis égouttez-les en retournant l’assiette.
7. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 μL d’anticorps secondaires dilués dans les puits et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 h.
NOTE: L’anticorps secondaire utilisé était un anticorps anti-poly-raifort peroxydase (HRP) de chèvre perforant à une concentration de 0,25 μg/mL (dilution de 1:2 000 de 0,5 mg/mL de stock) dans une solution de diluant d’anticorps.
8. À l’aide d’une bouteille à eau, lavez les puits de l’assiette 3 fois avec du PBS-T en remplissant les puits, puis égouttez-les en retournant l’assiette.
9. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 100 μL de solution TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine)-ELISA (dosage immuno-enzymatique) (table des matériaux) et incubez à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité.
NOTE: La couleur d’une réaction positive serait une nuance de bleu.
10. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 μL de solution d’arrêt (acide sulfurique 2N).
NOTE: La couleur passera du bleu au jaune lorsque la solution d’arrêt sera ajoutée. La couleur est stable jusqu’à 30 minutes après l’arrêt de la réaction.
11. À l’aide d’un lecteur de plaques, lire le diamètre extérieur à 450 nm.
12. Produire une courbe standard en mesurant la DO450 des dilutions en série de concentrations connues d’acide D-mannuronique (1 024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128 μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16 μg/mL et 8 μg/mL). Répétez l’opération 2 fois. À partir de ces lectures, extrayez une équation linéaire.
NOTE: La courbe standard ne doit être effectuée qu’une seule fois. L’équation linéaire qui en est extraite peut être utilisée pour des tests ultérieurs.
1. Calculez la concentration d’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et divisez la concentration d’alginate de l’équation linéaire par DO600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par DO600.