Modélisation de la colonisation vaginale murine par des bactéries anaérobies

Résumé

Source : Morrill, S. R., et al. Modèles de colonisation vaginale murine par des bactéries cultivées en anaérobie. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo présente un protocole de modélisation de la colonisation vaginale chez la souris à l’aide de bactéries anaérobies résistantes aux antibiotiques. Elle commence par un traitement hormonal pour augmenter la susceptibilité épithéliale, suivi d’une inoculation vaginale et d’une co-inoculation dans des conditions anaérobies. La procédure se termine par un échantillonnage et une culture post-inoculation pour évaluer la colonisation bactérienne et la formation du biofilm.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de l’inoculum

NOTE: Cette section contient les étapes générales de la préparation de l’inoculum de Gardnerella vaginalis résistant à la streptomycine cultivé en anaérobie JCP8151B-SmR. Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées dans une chambre anaérobie.

1. Faites rouler tous les réactifs, y compris le bouillon New York City III préparé (NYCIII), la gélose et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans une chambre anaérobie pour équilibrer pendant au moins 24 heures avant de l’utiliser.
   NOTE: Ici, une chambre anaérobie en vinyle équilibrée avec un mélange d’hydrogène gazeux à 5 % a été utilisée. La concentration interne d’oxygène se situe généralement à 0 ppm, bien qu’il puisse y avoir des augmentations transitoires de faible niveau (10-25 ppm) lors du recyclage des matériaux dans la chambre.
2. Deux jours avant l’inoculation vaginale, prélever Gardnerella d’un stock de glycérol congelé sur une plaque de gélose NYC III dans la chambre anaérobie. Utilisez un petit récipient (comme une boîte d’embout de pipette vide) rempli de glace sèche pour conserver le stock de glycérol congelé pendant le transport à l’intérieur et à l’extérieur de la chambre.
3. 1 jour avant l’inoculation vaginale, utilisez 5 à 10 colonies individuelles de Gardnerella de la plaque pour inoculer 10 ml de bouillon NYC III. Laisser la culture liquide croître pendant une nuit pendant 16 h à 37 °C. Inclure une deuxième aliquote de 1 mL du milieu de culture non inoculé et l’incuber en même temps que la culture inoculée pour confirmer que le milieu n’est pas contaminé.
4. Préparez l’inoculum à partir d’une culture liquide comme décrit ci-dessous. Effectuez la préparation de l’inoculum dans la chambre anaérobie autant que possible.
   1. Déterminer la densité optique (DO) de la culture en ajoutant 200 μL de culture à 800 μL de milieu frais dans une cuvette de 1,5 mL (dilution 1:5). À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la masse volumique de la culture diluée à une longueur d’onde de 600 nm (utilisez une cuvette séparée avec un milieu frais seul comme blanc). Multipliez la lecture de DO par 5 pour obtenir la DO réelle_{de 600} de la culture de 16 heures.
   2. Calculer le volume d’inoculum nécessaire à l’expérience. Par exemple, pour infecter 15 souris avec un inoculum de 20 μL par souris, il faut 15 x 20 μL = 300 μL d’inoculum. Préparez environ 25 % plus d’inoculum que nécessaire, donc pour 15 souris, préparez 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL d’inoculum.
   3. À l’aide de la DO₆₀₀ déterminée à l’étape 1.4.1, calculez le volume de la culture de 16 h qui doit être essoré et remis en suspension pour obtenir un inoculum de_{DO 600} = 5,0 dans le volume calculé à l’étape 1.4.2. Par exemple, si la DO₆₀₀ de la culture est de 1,5 et que le volume d’inoculum nécessaire est de 375 μL, alors le volume de la culture à filer est de (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
   4. Pipeter le volume de culture calculé à l’étape 1.4.3. dans un tube de microcentrifugation stérile. Granulez les bactéries en les centrifugeant à 16 000 x g pendant 1 à 3 min.
   5. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans du PBS anaérobie au volume calculé à l’étape 1.4.2. L’inoculum sera maintenant à une DO₆₀₀ calculée de 5,0. Le cas échéant, préparez également un tube de PBS qui servira de véhicule de contrôle pour les souris du groupe témoin non infecté.
5. Avant de retirer le tube d’inoculum de la chambre anaérobie, préparer une série de dilutions en série de 1:10 à 1:10 x 10⁶ en PBS. Placer 5 répétitions de chaque dilution sur une plaque de gélose à l’aide d’une pipette multicanaux pour déterminer les unités formant colonies ou UFC de l’inoculum. Il s’agit de l’UFC de pré-inoculation.
6. Pré-lavage vaginal et inoculation avec Gardnerella
   1. Préparez des tubes de lavage vaginal dans la chambre anaérobie. Pipeter 70 μL de PBS stérile et anaérobie dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL marqués avec des numéros de souris. Préparez un tube de lavage par souris. Fermez hermétiquement les tubes et sortez-les de la chambre anaérobie.
   2. Effectuez un lavage vaginal sur chaque souris avec 50 μL de PBS anaérobie à partir des tubes individuels préparés à l’étape 2.1. Ces lavages vaginaux sont les lavages de pré-inoculation et peuvent être utilisés pour les mesures et les tests en aval.
      1. Après l’administration de la deuxième injection de valérate de β-œstradiol, placez chaque souris sur une cage ou une surface propre et dure qu’elle peut saisir avec ses pattes avant. Saisissez doucement la partie médiane de la queue et soulevez-la de manière à ce que l’arrière-train soit légèrement surélevé et que l’ouverture vaginale soit exposée.
      2. À l’aide d’une pipette et d’un filtre-filtre p-200, prélevez 50 μL de PBS dans le tube de lavage correspondant à la souris appropriée. Insérez doucement l’embout de la pipette dans la lumière vaginale de ~2-3 mm, et pipetez doucement le volume de 50 μL vers l’intérieur et l’extérieur, 3x-4x.
      3. Transférez le matériau de lavage collecté (~50 μL) dans le même tube de lavage d’où il provient, en pipetant de haut en bas dans le tube de lavage qui contient encore les 20 μL restants de PBS. S’il y a trop de mucus et que l’embout est bouché, utilisez un embout p200 propre pour recueillir le matériau restant et placez-le dans le même tube de lavage.
   3. Administrer par voie vaginale 20 μL de la suspension bactérienne concentrée ou du contrôle du véhicule dans le vagin de chaque souris. Inoculer chaque souris immédiatement après le lavage vaginal pour cette souris (c.-à-d. effectuer le lavage et l’inoculation en séquence pour chaque souris avant de passer à la suivante). Pour simplifier ce processus, utilisez deux pipettes p200, l’une réglée à 50 μL pour les lavages et l’autre à 20 μL pour les inoculations.
      1. Retenez la souris comme décrit à l’étape 2.2.1. À l’aide d’une pointe p-200, pipeter 20 μL de suspension bactérienne dans le vagin. Pour les expériences de co-inoculation utilisant deux espèces/souches bactériennes différentes, utilisez 10 μL de chaque suspension bactérienne et évitez de mélanger les deux souches avant l’inoculation.
         NOTE: Le volume total d’inoculation ne doit pas dépasser 20 μL pour éviter tout débordement par le vagin.
      2. Continuez à tenir l’extrémité postérieure de chaque souris pendant 10 à 20 secondes pour éviter que le volume administré ne s’accumule immédiatement au niveau de l’introït vaginal. Ensuite, placez la souris dans une nouvelle cage/réceptacle ou avec des compagnons de cage qui ont déjà été inoculés.
      3. Répétez l’étape 2.2. et l’étape 2.3. pour chaque souris. Ne remettez jamais les souris dans une cage avec des animaux qui n’ont pas encore été inoculés. Cela permet d’éviter l’exposition par inadvertance des souris à des bactéries résistantes à la streptomycine avant l’inoculation.
   4. Une fois que toutes les souris ont été inoculées, retournez le tube d’inoculum dans la chambre anaérobie. Préparez et plaquez une autre dilution en série comme décrit à l’étape 1.5. Il s’agit de l’UFC post-inoculation. Comparer les UFC des plaques de post-inoculation et de pré-inoculation pour déterminer si la viabilité de l’inoculum a diminué à l’extérieur de la chambre anaérobie pendant l’inoculation des animaux.
   5. Plaquez les lavages vaginaux collectés à l’étape 2.2. sur gélose sélective (dans ce cas, 1 mg/mL de streptomycine). Incuber les plaques pendant 1 à 2 jours dans une chambre anaérobie à 37 °C et examiner la croissance. REMARQUE : La croissance indique que les membres endogènes du microbiome sont résistants au marqueur de sélection et peuvent donc obscurcir le dénombrement de l’UFC de l’organisme cible.
7. Collecte de lavages vaginaux pour déterminer la viabilité de la colonisation par Gardnerella
   1. Collectez les lavages vaginaux à des moments choisis pour analyser la colonisation vaginale. Collectez comme décrit à l’étape 2.2.
   2. Immédiatement après le prélèvement, faites passer les lavages vaginaux dans une chambre anaérobie. Utiliser 10 μL de chaque lavage pour effectuer la dilution en série et le placage sur gélose sélective comme décrit à l’étape 1.5. Utilisez le nombre d’UFC comme mesure de la colonisation vaginale par Gardnerella (ou un autre anaérobie d’intérêt).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
β-œstradiol-17-valérate	Sigma	E1631	œstrogène de souris
1x PBS	Pêcheur	MT21040CM	lavage vaginal, préparation de l’inoculum de G. vaginlalis , prélèvement et homogénéisation des tissus
Chambre anaérobie	Timide	7200000	Croissance des bactéries anaérobies
Bacto agar	Pêcheur	DF0140074	G. vaginalis, F. nucleatum et P. bivia agar plates
Glucose	Sigma	G7528	Milieux NYCIII pour la croissance de G. vaginalis
HEPES	Cellgro	Référence 25-060-CL	Milieux NYCIII pour la croissance de G. vaginalis
Sérum de cheval	Hémostat	SHS500	Milieux NYCIII pour la croissance de G. vaginalis
Mélange gazeux d’hydrogène (5 % d’hydrogène, 10 % de CO₂, 85 % d’azote)	Matheson		Gaz pour chambre anaérobie
Purificateur d’eau Milli-Q	Millipore	IQ-7000	pour la fabrication de milieux et l’homogénéisation
NaCl	Sigma	S3014	Milieux NYCIII pour la croissance de G. vaginalis
Azote	Gaz à air		Gaz pour chambre anaérobie
P-200 Pointes de filtre	Biographie de l’ISC	Réf. P-1237-200	lavages vaginaux et inoculations bactériennes
Huile de sésame	Pêcheur	ICN15662191	œstrogène de souris
Spectrophotomètre	BioChrom	80-3000-45	mesure de la DO₆₀₀ bactérienne
Streptomycine	Gibco	11860038	Ajouter à la gélose pour faire des plaques sélectives
Extrait de levure	Pêcheur	Référence : DF0127-17-9	Milieux NYCIII pour la croissance de G. vaginalis