Livraison localisée de bactéries dans la lumière intestinale d’une larve de poisson-zèbre par micro-injection

Résumé

Source : Li, J. et al. Développement d’un modèle d’infection larvaire du poisson-zèbre pour Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’administration par micro-injection de Clostridioides difficile marqué par fluorescence dans la lumière intestinale d’une larve de poisson-zèbre anesthésiée. Il décrit les étapes de la préparation larvaire, de l’injection bactérienne et de la confirmation de la localisation bactérienne dans l’intestin par microscopie à fluorescence.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection de Clostridioides difficile coloré dans des larves de poisson-zèbre

1. Anesthésier 20 à 30 larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation (appelé ici 5 dpf) avec 0,02 % à 0,04 % de tricaïne (la poudre de tricaïne est dissoute dans de l’eau doublement distillée et ajustée à pH = 7 avec une solution de 1 M de Tris-HCL) dans un milieu de Danieau à 30 % ~10 min avant l’injection. Transférez les larves anesthésiées dans une boîte de Pétri fraîche de 10 cm et retirez tout excès de milieu de Danieau à 30 %.
2. Placez une goutte d’agarose à faible fusion à 0,8 % sur les larves de poisson-zèbre pour les couvrir. Ajustez doucement les larves en position latérale. Placez la boîte de Pétri sur de la glace pendant 30 à 60 s pour permettre à l’agarose à faible point de fusion de se solidifier. Ajouter 30 % de milieu de Danieau contenant 0,02 % à 0,04 % de tricaïne pour couvrir l’agarose.
3. Préparez la solution injectable. Ajouter 1 μL de rouge de phénol à 0,5 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans 9 μL de l’inoculum de Clostridioides difficile coloré pour visualiser le processus d’injection.
4. Chargez une aiguille de micro-injection calibrée avec la solution d’injection à l’aide d’un microchargeur. Montez l’aiguille chargée sur un micromanipulateur et placez-la sous un stéréomicroscope.
5. Ajustez la pression d’injection entre 600 et 900 hPa. Réglez le temps d’injection sur 0,1 à 0,3 s pour obtenir 0,5 à 1,0 nL. Placez l’aiguille dans le micromanipulateur à un angle de ~45° pointant vers les larves incrustées.
6. Placez la pointe de l’aiguille au-dessus du tractus gastro-intestinal, près du pore urogénital. Percez l’agarose, puis le muscle avec la pointe de l’aiguille, puis insérez-le dans la lumière intestinale et injectez 0,5 à 1,0 nL de Clostridioides difficile. Utilisez un microscope à fluorescence pour surveiller les larves injectées et prélever les larves correctement injectées pour l’imagerie confocale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose à bas point de fusion (LM)	Pronadisa	8050	Il est utilisé dans les plaques d’agarose
Tache bactérienne rouge BacLight	Thermo Fisher Scientific	Réf. B35001	Colorant fluorescent
Verre capillaire	Appareil de Harvard	30-0019	Aiguilles d’injection
Clostridioides difficile			R20291, souche du ribotype 027, production de TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIDJI	Plateforme open-source		Traitement d'images
Micro-injecteur	Eppendorf	5253000017
Microscope confocal Leica SP8	Leica
Rouge phénol	Sigma-Aldrich	Réf. P0290
Tricaïne	Sigma-Aldrich	E10521