Isolement et culture de bactéries Clostridioides difficile à partir de larves d’intestin de poisson-zèbre

Résumé

Source : Li, J., et. al., Développement d’un modèle d’infection larvaire du poisson-zèbre pour Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’isolement et l’élevage de la bactérie Clostridioides difficile dans l’intestin de larves de poisson-zèbre. L’intestin infecté est disséqué, homogénéisé et incubé dans un milieu anaérobie sélectif contenant des antibiotiques. Ces conditions suppriment les microbes concurrents et favorisent la croissance de cellules viables.

Protocole

Dissection d’une larve d’intestin de poisson-zèbre pour récupérer des Clostridioides difficile viables

1. Isolez les tractus gastro-intestinaux des larves pour analyser la charge bactérienne. Commencez par euthanasier les larves de poisson-zèbre avec 0,4 % de tricaïne.
2. Rincez brièvement le poisson-zèbre avec du PBS stérile 1x (solution saline tamponnée au phosphate) et transférez-le dans une plaque d’agarose fraîche.
3. Dissection du poisson-zèbre
   1. Insérez une aiguille dans le tronc dorsal des larves de poisson-zèbre près de la tête pour immobiliser le poisson-zèbre. Retirez la tête derrière les branchies avec une lancette.
   2. Insérez la deuxième aiguille au milieu du tronc dorsal. Insérez la troisième aiguille dans l’abdomen du poisson-zèbre et retirez l’intestin de la cavité corporelle.
      NOTE: Des précautions extrêmes sont nécessaires pour isoler l’intestin intact. S’il est difficile de le faire, effectuez des tractions supplémentaires pour séparer le reste de l’intestin des organes internes restants.
   3. À l’aide d’une aiguille de micro-injection, transvaser 10 à 15 intestins dans un tube de 1,5 mL contenant 200 μL stériles de 1x PBS.
   4. Homogénéisez les intestins à l’aide d’un pilon pour perturber les tissus et préparez des homogénats. Assurez-vous que le pilon atteint le fond du tube pour perturber complètement tous les intestins.
4. Incuber les homogénats dans un milieu d’élevage de C. difficile contenant de la D-cyclosérine et de la céfoxitine, avec ou sans taurocholate (TCA, un germinant de spores de C. difficile ) dans une chambre anaérobie.
5. Incuber la plaque en anaérobie pendant 48 h à 37 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Agarose gélifiante ultra-faible
Agarose à bas point de fusion (LM)	Pronadisa	8050	Il est utilisé dans les plaques d’agarose
Clostridioides difficile			R20291,, une souche de ribotype 027, production de TcdA+/TcdB+/CDT+
Extracteur d’aiguille horizontal	Sutter instrument Inc	P-87
Micro-injecteur	Eppendorf	5253000017
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tricaïne	Sigma-Aldrich	E10521