Renaissance et croissance des bactéries lactiques

Résumé

Source : Ayivi, R. et al., La culture, la croissance et la viabilité des bactéries lactiques : une perspective de contrôle de la qualité. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la méthode de récupération des bactéries lactiques stressées par le froid à partir d’un stock de glycérol congelé, de restaurer la viabilité bactérienne par incubation anaérobie et d’isoler les colonies actives pour l’expansion de la culture.

Protocole

1. Protocole d’activation et de contrôle de la qualité des cultures de bactéries lactiques (LAB)

1. Sortez le stock de glycérol préparé des souches LAB (dans des tubes à centrifuger de 2 ml) du congélateur à très basse température de -80 °C et ne les laissez pas décongeler avant utilisation.
2. Nettoyez et désinfectez l’ouverture des tubes à centrifuger avec de l’alcool à 70 %, et agitez doucement avant utilisation.
3. Pipeter environ 250 μL (0,25 ml) de la culture mère LAB des tubes à centrifuger dans des tubes à essai MRS frais de 2 mL (milieux deMan, Rogosa et Sharpe).
4. Vortex doux, parafilmez les tubes à essai et incubez-les en anaérobie pendant une nuit à 42 °C pendant 12 à 16 h.
5. Prélever environ 500 μL (0,5 ml) des cultures cultivées pendant la nuit des tubes à essai MRS de 2 mL dans des tubes à essai MRS frais de 7 mL, vortex, et les incuber en anaérobie pendant une nuit à 42 °C pendant 12 à 16 h.
6. Évaluez la croissance microbienne en mesurant la densité optique (DO) ou la croissance des cultures à 610 nm avec un spectrophotomètre UV-visible et en enregistrant des résultats acceptables entre 0,7 et 0,9.
7. Striez les cultures d’une nuit à partir des tubes de 7 mL de SRM sur des plaques de gélose MRS et MRCM-PYR (milieu clostridien renforcé modifié-pyruvate) et incuberez-les en anaérobie pendant 72 h à 42 °C.
8. Les colonies isolées sont prélevées sur les plaques de gélose, transférées dans des tubes à essai MRS frais de 7 mL, légèrement vortex et incubées en anaérobie pendant une nuit à 42 °C pendant 12 à 16 h.
9. Conservez les plaques de gélose contenant les souches isolées à 4 °C au réfrigérateur pendant une semaine.
10. Mesurer et confirmer la DO (entre 0,7 et 0,9) des tubes à essai MRS de 7 mL des cultures LAB isolées des plaques striées à 610 nm et les utiliser comme cultures de travail pour toutes les expériences connexes.
11. Pour obtenir un rapport de 1:10, effectuez des dilutions d’une dizaine de fois (dilutions en série) des cultures LAB cultivées à partir des tubes à essai MRS finaux de 7 mL en utilisant 9 mL d’eau peptonée (un tampon physiologique).
12. Enfin, prélever environ 250 μL (0,25 mL) à partir de dilutions en série appropriées pour toutes les expériences de fermentation.
13. Activer le bouillon contenant des souches (250 μL) à partir de l’étape 2.12 en les transférant dans du bouillon MRS frais de 7 mL et en les incubant en anaérobie à 42 °C pendant 16 h.
    NOTE: Toutes les souches de L. bulgaricus ont été activées dans le bouillon MRS fraîchement préparé, puis ont été incubées en anaérobie à 42 °C pendant 16 h afin d’atteindre une densité optique (DO₆₁₀ nm) de croissance bactérienne comprise entre 0,7 et 0,9. La croissance bactérienne a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible à 610 nm. Les valeurs de pH des cultures de nuit étaient de l’ordre de 3,5 à 5,3 en raison de la production d’acide lactique, un produit final biologique de la fermentation LAB. Les procédures de sécurité, telles que la bonne circulation de l’air dans la hotte de biosécurité et l’évitement des brûlures lors de l’utilisation du bec Bunsen, ont été respectées et observées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bleu aniline	Thermo Scientific	Réf. R21526	25 grammes
Extrait de bœuf	Produits de recherche internationale	50-197-7509	500 grammes
Extrait de levure	Fisher Scientific	Réf. BP1422-500	500 grammes
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Scientific	Réf. C79-500	500 grammes
Dextrose anhydre	Fisher Scientific	BP350500	500 grammes
D-fructose	ACROS Organics	AC161355000	500 grammes
Poudre de gélose Difco	Difco	Référence : DF0812-07-1	2 kg
Gélose TPY	Difco	211921	500 grammes
Eppendorf microcentrifuge tube (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycérol	Thermo Scientific	PI17904	500 ml
Incubateur CO₂ infrarouge	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Collection de culture de type américain (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgarie	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgarie	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratoire de microbiologie et biotechnologie des aliments (NCATSU)	CHOUCAS
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratoire de microbiologie et biotechnologie des aliments (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Laboratoire de microbiologie alimentaire et de biotechnologie (NCATSU)	RD2
Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté	Sigma-Aldrich	Réf. C6852-25G	25 grammes
Maltose monohydrate	Fisher Scientific	M75-100	100 grammes
Bouillon MRS	Néogène	50-201-5691	5 kg
Peptone n° 3	Hach	50-199-6719	500 grammes
Phosphate dibasique de potassium (K₂HPO₄)	Produits de recherche internationale	50-712-761	500 grammes
Acétate de sodium trihydraté	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
Pyruvate de sodium	Fisher Scientific	Réf. BP356-100	100 grammes
Tubes à essai avec bouchons à vis doublés de caoutchouc	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 millimètre
Préadolescent 80	Fisher Scientific	Réf. T164-500	500 ml
Congélateur ultra bas	Si bas
Uracile	ACROS Organics	AC157301000	100 grammes
Spectrophotomètre UV-visible	Thermo Fisher Scientific	Évolution 201
Vortex Génie 2	Fisher Scientific
Extrait de levure	Fisher Scientific	Réf. BP1422-500	500 grammes
Éthanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Acide chlorhydrique (6N (certifié), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 ml