Identification à haut débit de polymères répulsifs contre les bactéries par criblage de microréseaux

Résumé

Source : Venkateswaran, S., et al. Identification à haut débit de polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une méthode à haut débit pour identifier les polymères répulsifs aux bactéries à l’aide d’une lame de microréseau exposée à des cultures bactériennes mixtes. La liaison bactérienne est évaluée par fluorescence DAPI, où un signal réduit indique des polymères avec une fixation de surface minimale.

Protocole

1. Inoculation de microréseaux de polymères avec des bactéries

NOTE: Assurer une bonne technique d’asepsie. Toute la manipulation des cultures doit être effectuée dans un environnement stérile : soit à l’aide d’un bec Bunsen, soit dans une hotte à flux. Les cultures doivent être cultivées avec la disponibilité de l’oxygène, le milieu de croissance et la température ajustés aux besoins de chaque espèce.

1. Préparez des cultures de nuit en inoculant 5 mL de bouillon Luria-Bertani (LB : 10 g/L de Bacto-tryptone, 5 g/L de chlorure de sodium, NaCl et 10 g/L d’extrait de levure) avec une colonie d’une plaque. Incuber toute la nuit à 37 °C, en secouant à 200 tr/min (tours par minute).
2. Préparez des stocks de congélation de cultures de nuit en ajoutant du glycérol (concentration globale de 10 %) et conservez le stock à -80 °C.
3. Afin de déterminer le nombre de cellules à partir d’échantillons de souches bactériennes décongelées, effectuez des dilutions en série de chaque stock et cultivez les bactéries pendant la nuit sur des milieux solides. La détermination précise du nombre de cellules dans les stocks garantit une inoculation appropriée de chaque espèce.
4. Préparez l’inoculum pour les microréseaux. Les cultures monospécifiques sont cultivées comme ci-dessus et appliquées directement sur les microréseaux. BacMix-1 est un mélange bactérien de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), de Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) et de Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 est un mélange bactérien composé de Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae et Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Pour produire l’une ou l’autre culture mixte, mélanger pendant la nuit en volumes égaux (3 ml chacun) et diluer quatre fois avec du LB frais (jusqu’à environ 50 ml de volume final).
6. Placez les microréseaux de polymères stérilisés aux ultraviolets dans des plaques rectangulaires à 4 puits et incuberez-les avec 6 ml de cultures bactériennes mixtes à 37 °C avec une légère agitation (30 tr/min) pendant 5 jours.
7. Après l’incubation, rincer doucement les puces deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS : 137 mM de NaCl, 2,7 mM de chlorure de potassium, KCl, 10 mM d’hydrogénophosphate disodique, Na₂HPO₄, 1,8 mM de dihydrogénophosphate de potassium, KH₂PO₄) et incuber avec une solution de 1 μg/ml de colorant 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans du PBS pendant 30 min.
8. Lavez les lames de microarray tachées dans une assiette fraîche en les recouvrant de PBS et en remuant doucement, en changeant le PBS une fois. Sécher sous un flux d’air. Appliquez une lamelle en verre sur la lame de la puce et scellez-la avec de la colle. Une fois sec, stérilisez la surface extérieure avec de l’éthanol à 70 % (v/v).
9. Éliminer les cultures de façon sécuritaire en fonction de leur niveau de confinement.

2. Imagerie et analyse des microréseaux

1. Capturez des images uniques pour chaque point polymère dans les canaux en fond clair et DAPI (Excitation/Emission, Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Effectuez cette opération manuellement à l’aide d’un microscope à fluorescence ou à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé (avec une platine X-Y-Z contrôlée par un logiciel d’acquisition d’images) équipé d’un objectif 20X.
   NOTE: Ajustez le microscope pour obtenir des images à l’aide des canaux fond clair et DAPI. Assurez-vous que le gain et le temps d’exposition pour la capture d’image pour toutes les puces sont les mêmes.
2. Obtenez l’intensité moyenne de fluorescence de chaque point du canal DAPI en choisissant la zone du spot et en quantifiant la fluorescence à l’aide d’un logiciel de traitement d’images.
3. Pour la fluorescence de fond de chaque tache, obtenir des images des taches de polymère sur une réplication de microréseau incubée uniquement avec des milieux sans bactéries. Déduisez la fluorescence de fond de l’intensité de la tache pour obtenir la fluorescence des bactéries.
4. Calculez la valeur normalisée moyenne à partir des quatre points, représentant chaque polymère, utilisés pour comparer la liaison bactérienne de divers polymères.
5. Identifiez les polymères qui présentent le moins de liaison bactérienne (fluorescence la plus faible) comme polymères « touchés ».

Matériaux