Préparation de l’inoculum bioluminescent entérohémorragique d’Escherichia coli

Résumé

Source : Kuo, C., et al. Détection de la colonisation entérohémorragique d’Escherichia coli chez l’hôte murin par un système de bioluminescence in vivo non invasif. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la préparation d’une suspension entérohémorragique d’Escherichia coli exprimant la luciférase à partir de stocks congelés pour une utilisation comme inoculum oral dans des modèles animaux. Cela permet un suivi bioluminescent en temps réel de la colonisation intestinale pendant les études d’infection in vivo.

Protocole

1. Préparation de la bactérie EHEC ( Escherichia coli entérohémorragique) bioluminescente pour l’inoculation orale

NOTE: L’organigramme chronologique des procédures expérimentales pour la préparation de l’ECEH et le gavage oral de souris est présenté à la figure 1 pour faciliter la préparation expérimentale.

1. Striez la bactérie E. coli O157 :H7 EDL933 hébergeant le plasmide de la luciférase sur une plaque de gélose LB (Luria-Bertani) avec 50 μg/mL de kanamycine provenant d’un stock de -80 °C. Faites pousser les bactéries pendant 16 à 18 h à 37 °C.
2. Prélever une seule colonie dans la plaque de nuit et la cultiver dans un milieu de 3 mL LB avec 50 μg/mL de kanamycine pendant 16 à 18 h dans un incubateur à 37 °C à 220 tr/min.
3. Sous-culture de la bactérie (dilution 1:100) dans un bouillon de kanamycine (50 μg/mL) contenant de la LB pendant 2,5 à 3 h dans un incubateur à 37 °C à 200 tr/min. (Par exemple, ajoutez 2 ml de bactéries cultivées pendant la nuit dans un milieu de 200 ml LB avec de la kanamycine (50 μg/mL) supplémentée.)
4. Incuber les bactéries pendant 2,5 à 3 h et mesurer la valeur de la densité optique (DO) à 600 nm (DO₆₀₀) jusqu’à ce que la valeur soit comprise entre 0,9 et 1. Le nombre de cellules bactériennes est d’environ 10⁸ unités formant colonies (UFC)/mL.
5. Centrifuger les bactéries recultivées à 8 000 x g pendant 30 min, 4 °C.
6. Jetez le surnageant sans agiter la pastille de bactéries et lavez la pastille avec 100 ml de solution saline normale stérile à 0,9 % en l’agitant doucement.
7. Répétez les étapes 1.5 et 1.6 une fois.
8. Après le lavage, centrifugez la culture bactérienne à 8 000 x g pendant 30 min, 4 °C, et jetez délicatement le surnageant.
9. Condensez la pastille 100 fois avec 0,9 % de solution saline normale stérile. Par exemple, si 200 ml de bactéries sont centrifugés, ajoutez 2 ml de solution saline normale pour suspendre la pastille.
10. Confirmez la présence d’UFC de bactéries (elle doit être d’environ 10⁹ UFC/100 μL après condensation dans une solution saline normale) en appliquant une dilution en série de 10 fois.

Résultats

Figure 1 : Chronologie de l’organigramme de préparation expérimentale.

Vue d’ensemble du calendrier nécessaire pour préparer les bactéries bioluminescentes d’ECEH et prétraiter les souris avec de la streptomycine. A) Préparation à ECEH. (B) Préparation ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur Shaker	YIH DER	LM-570R	incubation de bactéries
Incubateur à secousses orbitales	PREMIÈRE FRAPPE	S300	incubation de bactéries
Glycérol	SIGMA	Référence G5516-1L	Utilisation pour la solution de stockage de bactéries
Chlorure de sodium	Sigma	31434-5KG-R	produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 10 g/L
Tryptone	CONDA pronadisa	Cat 1612.00	produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 10 g/L
Poudre d’extrait de levure	Affymetrix	23547-1 KG	produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 5 g/L
Agar-agar	CONDA pronadisa	Cat 1802.00	produit chimique pour la fabrication de la gélose LB
Kanamycine	Sigma	K4000-5G	antibiotiques, utilisation pour la séléciton
Streptomycine	Sigma	S6501-100G	antibiotiques, éliminer le microbiote chez la souris
Centrifugeuse à grande vitesse	Beckman Coulter	Avanti, J-26S XP	Utilisation pour la centrifugation des bactéries
Rotor à angle fixe	Beckman Coulter	JA25.5	Utilisation pour la centrifugation des bactéries
Rotor à angle fixe	Beckman Coulter	JLA10.5	Utilisation pour la centrifugation des bactéries
Flacons à centrifuger	Beckman Coulter	REF357003	Utilisation pour la centrifugation des bactéries
Flacons à centrifuger	Thermo Fisher scientifique	3141-0500	Utilisation pour la centrifugation des bactéries
Biophotomètre Eppendorf plus	Eppendorf	AG 22331 Hambourg	pour la mesure de la valeur OD600 des bactéries