Isolement de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir d’un échantillon d’eau pour analyse moléculaire

Résumé

Source : Ghadigaonkar, D. et Rath, A. Isolement et identification des bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo montre l’isolement et la préparation de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir d’un échantillon d’eau à l’aide de milieux sélectifs. L’ADN est extrait de bactéries résistantes aux antibiotiques et amplifié pour identifier les gènes bactériens résistants aux antibiotiques.

Protocole

1. Prélèvement et traitement des échantillons

1. Prélèvement d’échantillons
   1. Prélever le volume approprié de l’échantillon d’eau dans des récipients stériles, en veillant à ce qu’au plus les 3/4 du récipient soient remplis.
   2. Transportez les échantillons au laboratoire dans des conditions aseptiques dès que possible après le prélèvement et traitez-les immédiatement.
2. Traitement des échantillons
   1. Filtrez aseptiquement l’échantillon d’eau à travers un chiffon en mousseline stérile pour éliminer toute particule.
   2. Effectuez des dilutions en série appropriées de l’eau filtrée pour une analyse plus approfondie.

2. Estimation de la charge bactérienne totale et du nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques

1. Détermination de la charge bactérienne totale
   1. Mettre en suspension 18,12 g de poudre modifiée de gélose 2A de Reasoner (gélose R2A) dans 1 000 ml d’eau doublement distillée et dissoudre le mélange en chauffant. Autoclaver le mélange dissous à 121 °C, 15 livres par pouce carré (lb/po²) pendant 20 min. Préparer des plaques modifiées à la gélose R2A en versant la quantité appropriée du mélange autoclavé dans des plaques de Pétri stériles (p. ex., ajouter environ 20 ml de milieu stérile autoclavé à une plaque de Pétri stérile de 90 mm).
   2. Une fois que le milieu s’est solidifié, répartir uniformément 100 μL des dilutions appropriées de l’échantillon d’eau filtrée sur la gélose R2A, plaque modifiée. Effectuez l’expérience en double.
   3. Incuber toutes les plaques ci-dessus à 35 - 37 °C pendant 48 h (varier la température et le temps d’incubation en fonction du milieu utilisé pour l’isolement).
   4. Exprimer la charge bactérienne totale en unités formant colonies par millilitre (UFC/mL) à l’aide de l’équation (1) :
2. Détermination du nombre de bactéries AR
   1. Suivez les étapes 2.1.1 à 2.1.4. Cependant, au lieu de la gélose R2A, plaques modifiées, utilisez la gélose R2A, plaques modifiées complétées individuellement par cinq antibiotiques différents, à savoir le céfotaxime (3 μg/mL), la ciprofloxacine (0,5 μg/mL), l’érythromycine (20 μg/mL), la kanamycine (15 μg/mL) et la vancomycine (3 μg/mL).
   2. Ajouter les antibiotiques séparément dans des tubes contenant 20 mL de gélose R2A fondue stérile, modifiée (avec la température de la gélose R2A fondue, modifiée à ≤40 °C) pour atteindre la concentration finale d’antibiotique mentionnée à l’étape 2.2.1.
   3. Agitez pour un mélange uniforme et versez sur des plaques de Pétri stériles avant que la gélose ne se solidifie. Effectuez l’expérience en double.
   4. Incuber toutes les plaques ci-dessus à 35 - 37 °C pendant 48 h (la température et le temps d’incubation peuvent varier si vous utilisez un milieu différent).
   5. Pour le contrôle de la qualité et la vérification de l’efficacité des antibiotiques, étaler 100 μL de suspensions bactériennes des souches ATCC 25922 et Staphylococcus aureus ATCC 29213 sur leurs plaques R2A modifiées respectives contenant des antibiotiques (s’assurer que la densité de la culture fraîche utilisée pour l’inoculation est de densité optique, DO = 0,5 à 600 nm).
   6. Déterminer le nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques en termes d’UFC/mL, comme décrit à l’étape 2.1.4.

3. Identification de bactéries cultivables par séquençage du gène de l’ARN ribosomique (ARNr) 16S

1. Préparation d’une matrice d’ADN à partir des isolats pour l’amplification en chaîne par polymérase (PCR)
   1. À l’aide d’un cure-dent stérile, prélever une seule colonie isolée et pure de l’isolat qui pousse sur une plaque de Pétri. Suspendre la colonie bactérienne dans 100 μL d’eau stérile bidistillée dans un tube de microcentrifugation stérile et faire bouillir pendant 10 min.
   2. Centrifuger la suspension à 10 000 × g pendant 2 minutes pour granuler les débris, puis transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation neuf et stérile pour l’utiliser comme matrice d’ADN brut.
2. Amplification ciblée par PCR de la région V3 du gène de l’ARNr 16S et séquençage
   1. Préparez 40 μL du mélange réactionnel dans un tube PCR pour l’amplification par PCR, comme mentionné dans le tableau 1.
      NOTE: La préparation de l’ADN doit être effectuée sur un bloc de glace tout en minimisant les risques de contamination (porter des gants lors de la manipulation des réactifs et nettoyer soigneusement la surface de travail avec de l’éthanol à 70 %).
   2. Placez le tube dans le bloc thermique et exécutez le programme approprié dans le thermocycleur PCR. Voir le tableau 2 pour les conditions de cycle de PCR standardisées et les informations d’amorce pour l’amplification des régions V3 des gènes de l’ARNr 16S.

Tableau 1 : Constituants du mastermix PCR. La composition du mélange réactionnel de divers réactifs PCR.

Réactifs PCR	Volume (μL)
2x Taq Master Mix	20
Amorce avant (10 pico mole)	1.5
Amorce inversée (10 pico mole)	1.5
Modèle d’ADN brut	1.5
Eau de biologie moléculaire stérile	15.5
Volume total	40

 

 

 

 

 

 

 

Tableau 2 : Conditions du cycle de PCR pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S. Les conditions du cycle de PCR requises pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S sont présentées. Les étapes comprennent une étape initiale de dénaturation, suivie de 35 cycles de dénaturation, de recuit et d’extension, et d’une étape finale d’extension.

Direction	Séquence d’amorçage 5' – 3'	Conditions de PCR	Non. de cycles
En avant	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C pendant 10 min	1
		Dénaturation à 94 °C pendant 30 s	35
		Recuit à 50 °C pendant 30 s
		Extension à 72 °C pendant 40 s
Inverse	CTACCGGGGTATCTAATCC	Extension finale à 72 °C pendant 5 min	1

Matériaux