Un système de co-culture pour étudier les réponses moléculaires des plantes hôtes et des bactéries en interaction

Dans cet article

Résumé

Source : Nathoo, N., et al. Un système de co-culture hydroponique pour l’analyse simultanée et systématique des interactions moléculaires et de la signalisation plantes/microbes. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo fait la démonstration d’un système de co-culture hydroponique pour étudier les interactions plantes-bactéries dans des conditions stériles. Les semis sont transférés dans un milieu de croissance stérile et acide, incubés et inspectés pour détecter toute contamination avant d’être inoculés avec Agrobacterium. Les bactéries activées se fixent aux racines des plantes, transfèrent l’ADN-T dans les cellules végétales et favorisent les changements moléculaires qui améliorent la colonisation bactérienne.

Protocole

1. Système de co-culture hydroponique

Préparez un milieu liquide Murashige et Skoog (MS) : 2,165 g/L de sels de base MS, 10 g/L de saccharose, 0,25 g/L d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES) et 59 mL/L de mélange de vitamines B5, pH 5,75.
Autoclave le support. Versez-en 18 ml dans chaque réservoir cylindrique stérile en verre ou en plastique transparent (boîtes de cristallisation, 100 x 80 mm2) avec couvercles stériles.
NOTE: Préstérilisez les réservoirs et les couvercles en les enveloppant dans du papier d’aluminium et en les autoclavage.
Dans une hotte stérilisée, à l’aide d’une pince stérile, transférez délicatement chaque carré de mailles contenant des semi-solides de 10 à 14 jours dans un réservoir cylindrique hydroponique (figure 1d). Scellez les couvercles sur les réservoirs à l’aide d’un ruban chirurgical poreux.
Cultivez les semis sur le grillage dans le réservoir pendant 72 h à 22-24 °C, avec une photopériode de 16 h et en secouant à 50 tr/min pour l’aération (Figure 1e).
NOTE: Cela permet aux plantes de s’adapter à l’environnement hydroponique avant l’inoculation (coculture) avec des micro-organismes. Cette période d’attente permettra également à une contamination microbienne accidentelle d’apparaître avant l’inoculation.
1. Commencer l’étape suivante la veille de la fin de la période d’incubation.
Cultiver Agrobacterium tumefaciens dans un milieu Agrobacterium (AB) (0,5 % p/v d’extrait de levure, 0,5 % p/v de tryptone, 0,5 % p/v de saccharose, 50 mM MgSO₄, pH 7,0) à 28 °C et agiter pendant la nuit jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique finale de 1,0 à 600 nm (DO₆₀₀), mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre, avec un milieu AB non inoculé à blanc.
NOTE: Une OD₆₀₀ de 1,0 équivaut à environ 10⁹ cellules/mL.
Lavez A . tumefaciens trois fois dans un volume égal de 0,85 % de NaCl. Remettre en suspension dans un volume égal d’eau stérile doublement distillée.
Avant l’inoculation, examinez soigneusement le réservoir avec les semis pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination ; Le fluide dans les réservoirs non contaminés doit être clair et transparent.
1. Jetez tout réservoir contenant un liquide trouble (contamination) et numérotez le reste des réservoirs. Prélevez une petite quantité (20 μL) de milieu hydroponique dans chaque réservoir numéroté et repérez-la sur une boîte de Pétri remplie de bouillon Luria (LB). Incuber le plat à 28 °C.
Ajouter immédiatement 50 μL de suspension d’A. tumefaciens (environ 5 x 10⁷ cellules, estimée à partir de la DO₆₀₀) dans chaque réservoir hydroponique numéroté. Co-cultivez les plantules d’Arabidopsis thaliana et d’A. tumefaciens à 22-24 °C avec une photopériode de 16 h et une agitation à 50 tr/min (Figure 3f).
1. Examinez la plaque LB tachetée à l’étape 1.7.1. Après 12 et 28 h d’incubation pour vérifier la stérilité des réservoirs. S’il y a contamination, n’utilisez pas le réservoir numéroté correspondant (inoculé avec des bactéries) pour d’autres essais en aval.
Si vous le souhaitez, surveiller la croissance d’A. tumefaciens à intervalles réguliers en prélevant un échantillon de milieu de la cuve et en mesurant la DO₆₀₀ à l’aide d’un spectrophotomètre avec un milieu provenant d’un témoin non inoculé à blanc (figure 2).
NOTE: Les symptômes de maladies des plantes devraient être apparents après 7 jours (figure 3).

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Résultats

Figure 1 : Système de coculture hydroponique plantes-microbes. Le panneau de gauche représente un organigramme décrivant les six étapes clés de l’assemblage et de l’exploitation du système de co-culture hydroponique. Le panneau de droite montre...