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1. Préparation de la solution
- Préparez 1 M de Tris-Cl, pH 7,8 en dissolvant 10,34 g de Tris HCl et 4,17 g de Tris OH dans 50 mL de dH2O dans une fiole de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer la solution A (20 mM de MgCl2, 0,7 M de saccharose, 10 mM de Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,10 g de MgCl2 (95,2 g/mol) et 11,98 g de saccharose (342,3 g/mol) dans 25 mL dedH2O dans une fiole de 125 mL. Ajouter 500 μL 1 M de Tris-Cl (pH 7,8) et ajuster le volume à 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer la solution B (10 mM de MgCl2, 0,8 M de saccharose, 10 mM de Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,05 g de MgCl2 (95,2 g/mol) et 13,69 g de saccharose (342,3 g/mol) dans 25 mL de dH2O dans une fiole de 125 mL. Ajouter 500 μL 1 M de Tris-Cl (pH 7,8) et ajuster le volume à 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
- Préparez du saccharose 0,8 M en dissolvant 13,69 g de saccharose (342,3 g/mol) dans 50 mLdH2O dans une fiole de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
- Préparez 5 mg/mL de désoxyribonucléase I (DNase I) en dissolvant 0,015 g de DNase I dans 3 mL dedH2O dans une fiole de 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm. Aliquote de la solution dans des tubes à microfuge et à conserver à -20 °C.
- Préparer l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,125 M, pH 8,0 en dissolvant 0,698 g d’EDTA disodique déshydraté (372,2 g/mol) dans 15 mLdH2O dans une fiole de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
- Préparez 600 μg/mL de céphalexine en dissolvant 0,03 g d’hydrate de céphalexine (365,404 g/mol) dans 50 mL dedH2O dans une fiole de 125 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et stocker dans un tube conique à 4 °C.
- Préparez 5 mg/mL de lysozyme en dissolvant 0,015 g de lysozyme dans 3 mL de dH2O dans une fiole de 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm. Aliquote de la solution dans des tubes à microfuge et à conserver à -20 °C.
- Préparez du bouillon de soja trypticase à 3 % p/v en dissolvant 30 g de TSB dans 1 L de dH2O dans une fiole de 2 L. Aliquote la solution dans des flacons contenant 25 mL ou 100 mL de TSB à utiliser dans la préparation des sphéroplastes d’E. coli . Fioles d’autoclave pour stériliser le milieu liquide. Les TSB stériles peuvent être conservés à température ambiante ou à 4 °C.
2. Préparation de la culture de nuit
NOTE: Effectuer les sections 2 et 3 en utilisant des techniques stériles appropriées. Si vous le souhaitez, une souche bactérienne peut contenir un plasmide de résistance aux antibiotiques afin de réduire la contamination potentielle. Si vous utilisez une souche résistante aux antibiotiques, ajoutez les antibiotiques nécessaires aux étapes 2.1 et 3.1 à 3.2.
- Préparez une culture de nuit en prélevant une seule colonie de bactéries à l’aide d’une pointe de pipette stérile et en la plaçant dans un tube de culture de 14 ml contenant 2 à 3 ml de BST à 3 % p/v. Incuber à 37 °C, en agitant pendant 16 à 21 h.
3. Préparation des sphéroplastes à E. coli à Gram négatif
- Dans une fiole de 250 mL, diluer la culture de nuit à l’ordre de 1:100 dans un volume de 25 mL de TSB à 3 % p/v et incuber la solution bactérienne à 37 °C, en agitant pendant environ 2,5 h jusqu’à ce que la solution ait atteint une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nm. Mesurez la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Dans une fiole de 250 mL, diluer cette culture à l’échelle 1:10 dans 30 mL de TSB à 3 % p/v et incuber à 37 °C, tout en agitant pendant 2,5 h en présence de 60 μg/mL de céphalexine (347,4 g/mol) pour produire des filaments unicellulaires d’environ 50 à 150 μm de longueur, qui sont observables sous un grossissement de 1 000X à l’aide d’un microscope optique (figure 1B).
- Récoltez les filaments en centrifugeant la solution bactérienne à 1 500 x g, 4 °C pendant 4 min. Décantez et jetez le surnageant en réservant le granulé.
- Lavez les filaments en ajoutant délicatement 1 mL de saccharose 0,8 M, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Incuber pendant 1 min, puis jeter le surnageant sans déranger la pastille.
- Ajouter à la pastille 150 μL de 1 M de Tris-Cl (pH 7,8), 120 μL de lysozyme à 5 mg/mL, 30 μL de DNase I à 5 mg/mL et 120 μL d’EDTA 0,125 M dans leur ordre respectif et incuber la solution à température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter 1 mL de solution A progressivement sur 1 min à la solution préparée en 3,5 à l’aide d’une micropipette tout en remuant doucement la solution à la main. Incuber la solution pendant 4 min à température ambiante.
- Mettre 7 mL de solution B à 4 °C dans deux tubes coniques de 15 mL. Ajoutez des quantités égales de la solution préparée en 3.6 dans chacun de ces deux tubes. Centrifuger la solution à 1 500 x g, 4 °C pendant 4 min.
- À l’aide d’une pipette sérologique, prélever avec précaution tout le surnageant, sauf 1 à 2 ml, sans déranger la pastille. Remettez le granulé en suspension en le pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une micropipette P1000. Vérifiez visuellement la formation des sphéroplastes en observant l’échantillon à un grossissement de 1 000X à l’aide d’un microscope optique (Figure 1C).
- Conservez les sphéroplastes à -20 °C pendant une semaine ou jusqu’à ce qu’ils aient subi 3 cycles de gel-dégel.
