Génération de protoplastes à partir de la bactérie à Gram positif Bacillus megaterium

Résumé

Source : Figueroa, D. M., et al. Production et visualisation de sphéroplastes et protoplastes bactériens pour caractériser la localisation des peptides antimicrobiens. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre une procédure étape par étape pour générer des protoplastes à partir de la bactérie à Gram positif Bacillus megaterium.

Protocole

1. Préparation de la solution

1. Préparez 5 mg/mL de lysozyme en dissolvant 0,015 g de lysozyme dans 3 mL de dH₂O dans une fiole de 50 mL. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm. Aliquote de la solution dans des tubes à microfuge et à conserver à -20 °C.
2. Préparez du bouillon de soja trypticase à 3 % p/v en dissolvant 30 g de TSB dans 1 L de dH₂O dans une fiole de 2 L. Aliquote la solution dans des flacons contenant 100 mL de TSB à utiliser dans la préparation des protoplastes de B. megaterium . Fioles d’autoclave pour stériliser le milieu liquide. Les TSB stériles peuvent être conservés à température ambiante ou à 4 °C.
3. Préparez la solution C (1 M de saccharose, 0,04 M de maléate, 0,04 M de MgCl₂, pH de 6,5) en dissolvant 34,23 g de saccharose (342,3 g/mol), 0,46 g d’acide maléique (116,07 g/mol) et 0,38 g de MgCl₂ (95,21 g/mol) dans 100 ml de dH₂O dans une fiole de 250 ml. Ajustez le pH à 6,5. Stériliser en filtrant à travers un filtre à seringue de 25 mm avec une membrane de 0,2 μm et conserver dans un tube conique à température ambiante.
4. Préparez 200 mL de protoplast en mélangeant 100 mL de TSB à 3 % p/v et 100 mL de solution C dans une bouteille en verre de 1 L. Autoclave pour stériliser la solution et la conserver à température ambiante.

2. Préparation des protoplastes de B. megaterium à Gram positif

1. Dans une fiole de 250 ml, diluer la culture de nuit à l’échelle 1:1 000 dans 100 mL de TSB à 3 % p/v et incuber la solution bactérienne à 37 °C, en agitant pendant environ 4,5 h jusqu’à ce que la solution ait atteint une densité optique de 0,9 à 1,0 à 600 nm. Mesurez la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
2. Verser la culture liquide dans deux tubes coniques de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g, 4 °C pendant 10 min.
3. À l’aide d’une pipette sérologique, jeter le surnageant des deux tubes coniques. Remettez chaque pastille en suspension dans un milieu protoplast de 2,5 mL et combinez les solutions remises en suspension en un seul tube conique. Pipeter la solution combinée en suspension dans une fiole de 125 mL.
4. Ajouter 1 mL de lysozyme à 5 mg/mL et incuber pendant 1 h à 37 °C, en agitant la question.
5. Surveillez la croissance des protoplastes sous un grossissement de 1 000x à l’aide d’un microscope optique, en notant toute irrégularité, comme les bactéries qui apparaissent sous forme de bâtonnets gonflés au lieu de sphères (Figure 1). À l’aide d’une pipette sérologique, transférez la solution dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-la à 2 000 x g, à 4 °C pendant 10 min.
6. Décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu de protoplastre de 5 ml. Conservez les protoplastes à -20 °C pendant une semaine ou jusqu’à ce qu’ils aient subi 3 cycles de gel-dégel.

Résultats

Figure 1 : Images représentatives de B. megaterium. (A) Bactérie B. megaterium et (B) Protoplaste de B. megaterium . Les images ont été prises à un gross...

Matériaux