1. Inoculation des cellules (début de l’expérience)
- Après exactement 2 h, retirez les cultures bactériennes du matin de l’agitateur et centrifugez-les pendant 10 min (1 900 x g, 4 °C).
NOTE: Pour toutes les étapes suivantes, gardez toutes les suspensions bactériennes sur de la glace pour minimiser la croissance. - Remettre en suspension la pastille de bactéries dans le milieu de culture tissulaire (MTC) sans antibiotiques. À l’aide d’un spectrophotomètre, ajuster la densité optique (DO) à 0,7-0,9, puis diluer avec la MTC sans antibiotiques jusqu’à une concentration de 1 x 106 unités formant colonies (UFC)/mL (dilution d’environ 1:100). Utilisez cette suspension bactérienne pour infecter chaque insert avec 1 x 105 UFC par volume de 100 μL.
- Étiqueter la plaque de transpuits et infecter chaque insert avec 100 μL de l’inoculum ajusté en DO (un total de 1 x 105 UFC par insert). Le test a maintenant commencé. Notez le temps et notez-le comme t = 0 h.
- Plaquer la suspension bactérienne d’inoculum pour quantifier l’UFC/mL à l’aide de la méthode de dilution sur piste, en plaquant des aliquotes de 10 μL sur des plaques de gélose carrée LB.
2. Quantifier la transcytose
- Toutes les 30 minutes après l’inoculation, remplissez les nouveaux puits avec 500 μL de MTC sans antibiotiques. Transférez les inserts dans ces nouveaux puits à l’aide d’un ensemble différent de pinces stériles pour chaque souche bactérienne différente.
- Récupérez le milieu du puits de collecte usagé pour chaque insert dans des tubes étiquetés séparés. Placez ces tubes sur de la glace. Entre les points temporels, remettez les plaques transwell dans l’incubateur.
- Pour chaque insert, combinez les milieux collectés à partir de t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h et t = 2 h, et tourbillonnez brièvement. Plaquez le milieu collecté sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) en utilisant la méthode de dilution sur piste pour quantifier la quantité de bactéries transcytosées dans les 2 premières heures de l’expérience.
NOTE: Le fait de récupérer les bactéries toutes les 30 minutes et de les garder sur de la glace minimise la croissance bactérienne dans les puits collecteurs, et les mesures sont effectuées sur des bactéries principalement de transcytose. - Placez les plaques de gélose LB à dilution sur piste marquées dans l’incubateur bactérien à 37 °C sans CO2 supplémentaire, et remettez la plaque de transpuits T84 dans l’incubateur de culture tissulaire.
- À t = 4 h, répétez l’étape 2.3 en combinant les milieux collectés à partir de t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h et t = 4 h.
- À t = 6 h, répétez l’étape 2.3 en combinant les milieux collectés de t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h et t = 6 h. De plus, à t = 6 h, plaquez le média à partir des puits de contrôle.
3. Fin de l’expérience
- Mesurer et consigner la résistance électrique transépithéliale (TEER) à la fin de l’expérience, t = 6 h.
- Décontaminez la sonde en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 à 15 min. Si vous le souhaitez, jetez les inserts ou enregistrez/traitez-les pour des applications supplémentaires. Laissez les plaques de gélose LB incuber pendant la nuit, et désinfectez et/ou éliminez en toute sécurité tous les autres matériaux utilisés.
- Après une nuit d’incubation, compter les colonies bactériennes manuellement sur les plaques LB de dilution de la piste pour déterminer la quantité d’inoculum et la quantité de transcytose d’E. coli . Assurez-vous que les plaques de contrôle ne présentent aucune croissance bactérienne.