Préparation et induction de cultures de Borrelia burgdorferi pour la production de particules virales

Résumé

Source : Eggers, C. H. Manipulation génétique médiée par phage de la maladie de Lyme spirochète Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la préparation d’une culture génétiquement modifiée de Borrelia burgdorferi conçue avec de l’ADN de bactériophage dormant porteur d’un gène de résistance aux antibiotiques. Après la sélection et l’incubation d’un antibiotique, un inducteur chimique déclenche des dommages à l’ADN, conduisant à l’excision, à la réplication et à l’assemblage de nouveaux virions contenant le gène de résistance. Après une deuxième centrifugation et une remise en suspension, les cellules bactériennes hébergeant des particules virales matures sont prêtes pour les applications en aval.

Protocole

1. Préparation de la culture de B. burgdorferi pour la production de φBB-1

1. Préparez le milieu Barbour-Stoenner-Kelly complété par du sérum de lapin normal inactivé par la chaleur à 6,6 % (BSK). Pour 1 L de 1x BSK, mélanger les composants énumérés au tableau 1 dans 900 mL d’eau, ajuster le pH à 7,6 à l’aide d’hydroxyde de sodium 1 N et mélanger lentement à 4 °C pendant 2 à 4 h. Une fois le mélange terminé, vérifiez et réajustez le pH à 7,6 si nécessaire, et augmentez le volume à 1 L avec de l’eau. Stérilisez le milieu en le passant à travers un filtre de 0,22 μM (voir tableau des matériaux) et utilisez-le frais ou conservez-le à 4 °C pendant ≤2 mois.
2. Trois à cinq jours avant de commencer le protocole de transduction, inoculer 150 μL du ou des clones appropriés de B. burgdorferi dans 15 mL de 1x BSK dans des tubes à centrifuger coniques stériles bien bouchés (voir le tableau des matériaux). Compléter le milieu avec la concentration appropriée d’antibiotiques ou une combinaison d’antibiotiques pour la sélection et le maintien de l’ADN hétérologue dans le(s) clone(s) de B. burgdorferi (tableau 2).
   REMARQUE : B. burgdorferi est un organisme de niveau de biosécurité 2. Prenez toutes les précautions appropriées lorsque vous travaillez avec cet organisme. Effectuer tous les travaux avec des cultures vivantes de B. burgdorferi dans une enceinte de biosécurité de classe II certifiée et correctement désinfectée. Éliminez correctement tout le matériel qui entre en contact avec B. burgdorferi et les organismes eux-mêmes, conformément aux directives des Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
3. Incuber les cultures à 33 °C sans agiter jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité de ≥5 × 10⁷ spirochètes·mL⁻¹, ce qui prend environ 3 à 5 jours.

3. Induction du phage φBB-1 de B. burgdorferi

REMARQUE : Stérilisez toute la verrerie et la vaisselle en plastique par autoclavage ; stériliser toutes les solutions par autoclave ou filtration à travers un filtre de 0,22 μM. Les étapes ci-dessous sont présentées sur la base de volumes de 15 ml, mais la méthode peut être adaptée à des volumes plus ou moins importants en fonction des besoins individuels de l’expérience.

1. Pour la culture de B. burgdorferi à partir de laquelle le phage sera produit (le donneur), utiliser la concentration calculée par l’une ou l’autre des méthodes de l’étape 2 pour déterminer le volume de culture de démarrage nécessaire pour produire 4 mL de 2 × 10⁸ spirochètes·mL⁻¹. Cela donnera une concentration finale de 5 × 10⁷ spirochètes·mL⁻¹ dans 15 mL pendant la phase de récupération (étape 3.6 ci-dessous).
2. Centrifuger le volume de culture calculé à l’étape 3.1 à 6 000 x g pendant 10 min. Décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 4 mL de BSK frais. Transférez l’échantillon dans le plus petit tube stérile disponible pour contenir l’échantillon avec un minimum d’espace pour la tête.
3. Ajouter la quantité appropriée d’agent inducteur à la concentration recommandée (tableau 3) sur la base d’un volume de culture de 4 mL pour induire la production de phages. Fermez hermétiquement le tube et mélangez bien.
4. Incuber l’échantillon à 33 °C pendant 2 à 4 h.
5. Après l’incubation, transférez l’échantillon dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger l’échantillon à 6 000 x g pendant 10 min. Décanter le surnageant.
6. Remettre la pastille en suspension dans 15 mL de 1x BSK.

Tableau 1 : BSK pour la culture et la sélection de clones de B. burgdorferi pour les essais de transduction. La formulation et la préparation de 1,5x BSK pour l’élevage de B. burgdorferi et de 1,5x BSK pour la sélection en phase solide de clones de B. burgdorferi décrites ici sont basées sur Samuels. Différentes formulations de BSK (ou MKP) qui favorisent la croissance de B. burgdorferi n’ont pas encore été testées à l’aide de l’essai de transduction.

Composant	1x BSK (pour la culture) (1 L)	1,5x MDB (pour le placage) (1 L)
Albumine sérique bovine (fraction V)	35 grammes	52,5 grammes
10x CMRL-1066 (sans L-glutamine)	8 grammes	12 grammes
Néopeptone	4 grammes	6 grammes
Levure	1,6 g	2,4 grammes
HEPES	4,8 grammes	7,2 grammes
Glucose	4 grammes	6 grammes
Citrate de sodium	0,56 g	0,84 g
Pyruvate de sodium	0,64 g	0,96 g
N-acétyl-glucosamine	0,32 g	0,48 g
Bicarbonate de sodium	1,76 g	2,64 grammes
Sérum de lapin normal inactivé par la chaleur (INRS)	66 ml	99 ml

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tableau 2 : Antibiotiques potentiels et concentrations à utiliser pour la sélection et le maintien de l’ADN hétérologue chez B. burgdorferi. Cette liste est basée sur les marqueurs actuels de résistance aux antibiotiques couramment utilisés chez Borrelia burgdorferi. La kanamycine, la gentamicine et la streptomycine sont préparées dans de l’eau, stérilisées par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μM et stockées à -20 °C. L’érythromycine est préparée dans de l’éthanol à 95 % et stockée à -20 °C. De nombreux laboratoires signalent l’utilisation réussie de la kanamycine pour la sélection à une concentration de 200 μg·mL⁻¹ ; lors de l’utilisation de la gentamicine et de la kanamycine pour la sélection dans les essais de transduction, 400 μg·mL⁻¹ de kanamycine est utilisée. Le gène aadA confère une résistance à la fois à la streptomycine et à la spectinomycine. Pour la sélection des constructions contenant le gène aadA dans E. coli, 100 μg·mL⁻¹ de spectinomycine est utilisé. Notez que les aminosides (kanamycine, gentamicine et streptomycine) ne sont pas cliniquement pertinents dans le traitement de la maladie de Lyme ; Cependant, l’érythromycine est utilisée cliniquement dans certaines situations. Bien que l’on ait signalé une résistance naturelle à cet antibiotique chez B. burgdorferi , ce marqueur de résistance n’a pas été utilisé jusqu’à présent dans les essais de transduction rapportés ici.

Antibiotique	Concentration des stocks	Concentration finale dans la culture du Sib
Kanamycine	100 mg.mL-1 (dans l’eau)	200 à 400 μ g.mL-1
Gentamicine	50 mg.mL-1 (dans l’eau)	50 μ g.mL-1
Streptomycine	50 mg.mL-1 (dans l’eau)	50 μ g.mL-1
Érythromycine	2 mg.mL-1 (en EtOH)	0,06 μ g.mL-1

 

 

 

 

 

Tableau 3 : Agents inducteurs potentiels et concentrations utilisées pour l’induction de φBB-1 à partir de B. burgdorferi. Il a été démontré que la N-méthyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), la mitomycine C et l’éthanol, ainsi que le méthanol et l’isopropanol, induisent tous une φBB-1 supérieure aux niveaux constitutifs dans la souche CA.11-2A de B. burgdorferi . Le MNNG est un danger soupçonné d’être cancérogène et environnemental ; Utiliser avec prudence, dissoudre dans un solvant combustible et incinérer pour élimination. La mitomycine C est soupçonnée d’être cancérogène et constitue un danger potentiel pour l’environnement. Utiliser avec prudence sous une hotte chimique et l’éliminer correctement. Bien que les données publiées suggèrent que le MNNG est l’agent le plus efficace pour induire le φBB-1, les dangers du travail avec ce produit chimique et les difficultés à l’acquérir rendent son utilisation compliquée, en particulier pour les étudiants. L’induction avec l’éthanol est systématiquement meilleure qu’avec le méthanol ou l’isopropanol et a été le plus couramment utilisée dans le test de transduction.

Agent inducteur	Concentration de la pâte (solvant)	Concentration finale dans l’échantillon
Éthanol	100 % (aucun)	5%
Mitomycine C	2 mg.mL-1 (eau)	20 μ g.mL-1
1-méthyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	50 mg.mL-1 (DMSO)	10 μ g.mL-1

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Unités de filtration de 1 L (PES, pores de 0,22 μm)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
Tube de 12 mm x 75 mm (capuchon à double position) (polypropylène)	Scientifique américain	1450-0810	Contient 4 mL avec un faible volume de vide (pour l’induction)
Tubes à centrifuger coniques de 15 mL (polypropylène)	Scientifique américain	5618-8271
1-méthyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	Millipore Sigma		ATTENTION : cancérogène potentiel ; n’est plus facilement disponible, n’a pas testé le substitut proposé
Pipettes Pasteur 5,75" (bouchées en coton/verre borosilicaté/non stériles)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	autoclave avant utilisation
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL (polypropylène)	Scientifique américain	1500-1211
Éthanol absolu
Bacto Néopeptone	Gibco	Référence : DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Albumine sérique bovine (grade de remplacement sérique)	Bio-produits Gemini	700-104P
CMRL-1066 sans L-Glutamine (poudre)	Biologique des États-Unis	Référence C5900-01	Qualité de culture cellulaire
Érythromycine	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solution réactive de gentamicine	Gibco	15750-060
Glucose (dextrose anhydre)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfate de kanamycine	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (taille des pores de 0,22 μM)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	pour filtrer, stériliser, antibiotiques et autres solutions de petit volume
Mitomycine C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ATTENTION : cancérogène potentiel ; Utiliser uniquement dans une hotte chimique
N-acétyl-D-glucosamine	MP Biomedicals, LLC	100068
Boîte de Pétri (100 mm × 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Sérum de lapin non stérile à l’état de traces hémolysés jeunes (NRS)	Produits biologiques Pel-Freez	31119-3	inactivation de la chaleur selon les instructions du fabricant
Bicarbonate de sodium	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Pyruvate de sodium	Millipore Sigma	Réf. P8674-25G
Solution de sulfate de streptomycine	Millipore Sigma	S6501-50G
Citrate trisodique dihydraté	Millipore Sigma	S1804-500G	citrate de sodium pour BSK