Détection d’un analyte cible à l’aide d’un biocapteur bactérien

Résumé

Source : Barber, A. E., et al. Préparation et application d’un nouveau biocapteur bactérien pour la détection présumée des résidus de balle. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre la détection d’analytes spécifiques à l’aide d’un biocapteur bactérien. Une culture bactérienne portant un plasmide avec un gène de protéine fluorescente rouge (RFP) sous un promoteur sensible à l’analyte est prélevée. Après avoir soigneusement essuyé la surface d’essai, une petite partie de la lingette est immergée dans la culture et incubée. L’interaction de l’analyte avec le promoteur active l’expression de RFP, confirmant la présence de l’analyte cible.

Protocole

REMARQUE : La synthèse d’E. coli exprimant la protéine fluorescente rouge (RFP) est présentée.

1. Préparation de l’acide plasmidique désoxyribonucléique (ADN) à partir d’E . coli

1. Décongeler E. coli contenant un plasmide avec un gène RFP et un gène de résistance à l’ampicilline, et faire croître E . coli sur des plaques de gélose Luria Broth (LB) contenant 100 μg/mL d’ampicilline à 37 °C pendant 24 h. Par exemple, utilisez le plasmide J10060 du registre des pièces biologiques standard utilisées pour la biologie synthétique (voir la Table des matériaux). Le plasmide J10060 comprend un gène pour RFP sous le contrôle d’une région promotrice pBad et d’un gène de résistance à l’ampicilline. Alternativement, transformer E. coli (voir l’étape 3.2) avec le plasmide avant la croissance sur les plaques de gélose LB.
2. Suivez un protocole miniprep standard (voir la Table des matières) pour isoler l’ADN de 1 mL d’une culture d’E. coli contenant le plasmide J10060. Le but du protocole suivant est de supprimer le promoteur pBad et de le remplacer par le promoteur souhaité pour l’appareil.
3. Après la minipréparation du plasmide, conservez l’ADN au congélateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la digestion.

2. Digestion enzymatique de restriction

1. Mettre en place la réaction suivante dans un tube de microcentrifugation pour la digestion EcoRI et NheI : 10 μL d’ADN plasmidique J10060 (isolé à l’étape 1), 8 μL d’eau et 1 μL d’enzymes EcoRI et NheI prémélangés avec 1 μL de tampon (voir le tableau des matériaux).
2. Pour l’ADN du promoteur, mettez en place la réaction suivante dans un tube de microcentrifugation pour la digestion EcoRI et NheI : 10 μL de séquences d’ADN promoteur recuites (8 μL d’eau et 1 μL d’enzymes EcoRI et NheI pré-mélangées avec 1 μL de tampon.
   1. Pour l’antimoine (Sb-), le plomb (Pb-) ou le trinitrotoluène (TNT)-RFP (voir le tableau des matériaux), dissoudre les oligonucléotides dans un tampon (30 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), pH 7,5 ; 100 mM d’acétate de potassium), incuber à des concentrations molaires égales, chauffer à 94 °C pendant 2 min et refroidir progressivement à température ambiante).
3. Mélangez les échantillons en pipetant doucement de haut en bas avec la pipette réglée à 10 μL.
4. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
5. Inactiver les enzymes à 80 °C pendant 5 min.
6. Conservez l’ADN digéré au congélateur jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’étape suivante.

3. Ligature et transformation

1. Ligature
   1. À l’aide du plasmide et de l’ADN promoteur qui ont été digérés deux fois avec EcoRI et NheI à l’étape 2, mettre en place le mélange réactionnel illustré au tableau 1 dans un tube de microcentrifugation sur de la glace ; ajoutez la T4 DNA Ligase en dernier. REMARQUE : Le tableau 1 montre une ligature à l’aide d’un rapport molaire de vecteur de 1:3 à insérer pour les tailles d’ADN indiquées.
   2. Mélangez doucement la réaction en pipetant de haut en bas et microcentrifugez brièvement.
   3. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
   4. Inactiver la chaleur à 65 °C pendant 10 min.
2. Transformation
   1. Décongeler un tube contenant 20 μL de cellules EC5-alpha Competent E. coli sur de la glace jusqu’à ce que les derniers cristaux de glace disparaissent.
   2. Ajoutez 5 μL d’ADN plasmidique au mélange de cellules. Agitez soigneusement le tube 4 à 5 fois pour mélanger les cellules et l’ADN.
   3. Placez le mélange sur de la glace pendant 2 min.
   4. Choc thermique à exactement 42 °C pendant exactement 30 s. Ne pas mélanger.
   5. Placer sur la glace pendant 2 min. Ne pas mélanger.
   6. Pipette 380 μL de bouillon super optimal à température ambiante avec répression catabolite (SOC) dans le mélange. Étaler immédiatement sur une plaque de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et incuber toute la nuit à 37 °C.
   7. Vérifiez la croissance des plaques dans les 24 heures.
   8. Scellez les plaques avec un film d’étanchéité et conservez-les au réfrigérateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’étape suivante.

4. Réaction en chaîne par polymérase de colonie (PCR)

1. Ajouter dans un tube PCR (mettre en place 4 tubes réactionnels) les mélanges réactionnels indiqués dans le tableau 2.
2. Mélangez doucement les réactions en pipetant de haut en bas.
3. À l’aide d’une pointe de pipette jaune, grattez une colonie (ou une très petite région) d’E. coli transformé. Transférez une noisette de cette bactérie E. coli sur une nouvelle plaque LB/ampicilline/gélose qui a été sectionnée, puis insérez la pointe de la pipette dans le tube PCR. Agitez l’extrémité de la pipette pour mélanger E . coli avec le mélange PCR. Répétez l’opération trois fois de plus pour d’autres colonies. Transférez les tubes PCR dans une machine PCR et commencez le thermocyclage à l’aide du programme indiqué dans le tableau 3.
4. Exécutez l’électrophorèse sur gel à l’aide d’un gel d’agarose à 2 % (TAE (TAE 9Tris-Acétate-EDTA) pour déterminer quelles colonies ont la meilleure ligature dans le plasmide, et cultivez ces colonies sur une nouvelle plaque.
5. Conservez les plaques au réfrigérateur jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être testées. Préparez une culture liquide dans un bouillon Luria avec 100 μg/mL d’ampicilline ajoutée pour les tests chimiques.

5. Séquençage de l’ADN

1. Pour chaque échantillon, ajoutez 5 μL de plasmide, 4 μL d’amorce de séquençage et 3 μL d’eau désionisée.
2. Placez ce mélange dans un tube et envoyez-le pour le séquençage de l’ADN (voir le tableau des matériaux).
3. Analysez les données de séquences d’ADN pour comparer les séquences d’ADN attendues et observées à l’aide d’un logiciel d’analyse de séquences d’ADN afin de vous assurer qu’il n’y a pas de mutation et que les gènes ont été correctement insérés.
   REMARQUE : L’utilisation d’E. coli comme capteur chimique est présentée ci-dessous.

6. Préparation des cultures d’E . coli

1. Préparez LB avec 100 μg/mL d’ampicilline pour les cultures liquides.
2. Préparez des cultures liquides des bactéries du capteur, des bactéries de contrôle positif* et des bactéries de contrôle négatif**.
   REMARQUE : *Bactéries témoins positives : E. coli contenant un plasmide avec le gène RFP sous le contrôle d’un promoteur constitutif ; Le plasmide E1010 du registre des parties biologiques standard utilisé pour la biologie synthétique (voir Table des matériaux) a été utilisé dans ce travail.**Bactéries témoins négatives : E. coli contenant un plasmide avec le gène RFP sous le contrôle d’un promoteur différent, tel que le promoteur pBad (plasmide J10060 du registre des parties biologiques standard utilisé pour la biologie synthétique (voir Table des matériaux) ou un plasmide qui n’a pas le gène RFP.
3. Placez les cultures dans un incubateur à agitation à 37 °C et 220 tr/min pendant un minimum de 8 h, un maximum de 18 h. Un bouillon trouble indique une croissance bactérienne.

7. Titrage d’E. coli pour vérifier le fonctionnement de l’appareil

REMARQUE : Une fois que les capteurs ont été titrés pour vérifier le fonctionnement, il n’est pas nécessaire de répéter cette étape. Un contrôle positif sous la forme de l’ajout de plomb, d’antimoine et de 2,4-DNT ou de 1,3-dinitrobenzène (1,3-DNB) peut vérifier le fonctionnement des appareils pour chaque utilisation sans qu’il soit nécessaire de procéder au titrage complet.

1. Préparer une solution mère de l’analyte ou des analytes d’intérêt à une concentration de 10 ppm dans l’eau. Si la solubilité est un problème, utilisez un mélange 50/50 d’eau et de méthanol.
2. À l’aide du tableau 4 , étiqueter le nombre approprié de tubes de culture stériles et placer 2 mL du bouillon de culture (à l’étape 6 du protocole) dans chaque tube.
   REMARQUE : Afin de déterminer une plage analytique générale, effectuez au moins trois niveaux différents d’un analyte avec les bactéries du capteur, un niveau avec le contrôle négatif et un niveau avec le contrôle positif. Il devrait également y avoir un tube de chacune des bactéries qui n’a pas de métal ajouté (un autre type de contrôle négatif). Pour déterminer avec plus de précision la plage analytique et les limites de détection, utilisez une plus grande plage de concentrations d’analytes.
3. Ajouter la solution mère d’analyte dans les tubes contenant 2 mL de bouillon comme indiqué au tableau 4, placer les bouchons à pression sur le tube de culture de manière à ce qu’ils soient lâches (pour permettre à l’air de circuler dans le tube) et agiter le tube de culture.
4. Laissez les boutons-pression sans serrer sur les tubes de culture et placez-les dans un incubateur à agitation à 220 tr/min et 37 °C pendant au moins 24 h.
5. Retirez les tubes de l’incubateur, enclenchez fermement les bouchons sur les tubes et conservez les tubes au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse de fluorescence.

8. Utilisation d’E . coli comme capteur chimique pour les résidus de balle (GSR)

1. À l’aide d’une lingette à base d’éthanol conçue pour enlever le plomb (voir le tableau des matériaux), essuyez toutes les surfaces des mains, y compris entre les doigts. Utilisez une lingette distincte pour chaque main. Conservez les lingettes dans un sac refermable étiqueté de manière appropriée jusqu’à l’analyse.
2. Pour les surfaces à tester, utilisez une lingette à base d’alcool pour les grandes surfaces ou un coton-tige imbibé d’éthanol pour les petites surfaces.
   REMARQUE : Pour démontrer la réponse des capteurs au GSR, l’intérieur d’une douille de cartouche de calibre .40 usagée a été nettoyé à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol.
3. En portant des gants propres et à l’aide de ciseaux nettoyés avec de l’alcool, coupez une section d’environ 1 cm² au centre de la lingette.
4. Placez le morceau coupé de la lingette pour les mains ou du coton-tige directement dans un tube de culture contenant 2 ml de bactéries capteurs, en veillant à ce qu’il soit immergé dans le bouillon.
5. Procédez comme décrit ci-dessus aux étapes 7.4 et 7.5.

Tableau 1. Mélange réactionnel pour la ligature, étape 3.1.1 du protocole.

COMPOSANT	20 μL RÉACTION
10X tampon d’ADN ligase T4	2 μL
ADN plasmidique (3 kb)	3 μL
ADN promoteur (0.7kb)	10 μL
Eau sans nucléases	4 μL
T4 ADN ligase	1 μL

 

 

 

 

 

 

Tableau 2. Mélanges réactionnels pour PCR de colonie, étape 4.1 du protocole.

Composant	Réaction de 25 μL
Amorce avant 10 μM	0,5 μL
Amorce inversée 10 μM	0,5 μL
UnMaster Mix Taq 2X	12,5 μL
Eau sans nucléases	11 μL

 

 

 

 

 

Tableau 3. Paramètres de thermocyclage PCR pour l’étape 4.3 du protocole.

PAS	INTÉRIMAIRE	HEURE
Dénaturation initiale	94 °C	30 secondes
30 cycles	94 °C	30 secondes
	55 °C	45 secondes
	68 °C	Années 60
Prolongation finale	68 °C	Durée : 5 minutes
Tenir	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tableau 4. Expérience générale mise en place pour le titrage des biocapteurs, étape de protocole 7.2.

Tube ID	Bactéries	Concentration de la solution d’analyte ajoutée (ppm)	Métal ajouté	Volume de solution d’analyte ajouté à 2 000 μL de bouillon	[analyte], ppb
1	PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP	10	Pb	75	361
3	PbRFP	10	Pb	150	698
4	PbRFP	0	aucun	0	0
5	Appel d’offres négatif	10	Pb	10	50
6	Appel d’offres pos	10	Pb	10	50

Matériaux