Essai d’essaimage pour la visualisation de la motilité de surface bactérienne

Résumé

Source : Morales-Soto, N. et al., Préparation, imagerie et quantification des essais de motilité de surface bactérienne. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre un test d’essaimage utilisant des bactéries qui expriment une protéine fluorescente verte pour observer la motilité de surface sur la gélose molle. L’imagerie en accéléré capture l’expansion coordonnée et la formation de vrilles, mettant en évidence la motilité de surface bactérienne.

Protocole

1. Préparation et inoculation du milieu d’essai en essaim

1. Préparation des supports
   NOTE: La composition moyenne décrite ci-dessous est applicable aux études de formation de vrilles de Pseudomonas aeruginosa . Veuillez consulter les spécifications du milieu dans le tableau 1 pour les dosages de motilité de surface de Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis et Myxococcus xanthus .
   1. Mélangez 200 ml de milieu d’essaim de bioréacteur aérobie fluidisé (FAB)-moins le sulfate d’ammonium ((NH4)₂SO₄) (tableau des matériaux), 0,9 g de gélose Noble et 0,2 g d’acides aminés (tableau 1) en agitant avec une barre d’agitation magnétique. Utilisez de petits volumes (100-300 ml) pour améliorer la cohérence entre les expériences.
   2. Autoclavez le mélange gélose/média de 200 ml en utilisant un temps d’exposition de 22 min, une température d’exposition de 121,1 °C et une option d’évacuation rapide. Les réglages de l’autoclave permettront une stérilisation et une fonte correctes de la gélose, mais empêcheront la caramélisation de la gélose.
      NOTE: L’agar noble est sujet à la caramélisation ; La motilité bactérienne est altérée sur la gélose caramélisée.
   3. Immédiatement après la fin du cycle de stérilisation, fermez le bouchon de la bouteille de média pour éviter la perte d’eau par évaporation. Cependant, notez qu’un bouchage serré peut provoquer un effet de type « scellement sous vide » sur la bouteille.
   4. Refroidir le milieu à 50 °C en remuant à température ambiante (RT) et ajouter 2 ml de glucose stérile de 1,2 M. Vous pouvez également placer le milieu dans un incubateur à 60 °C ou un bain-marie jusqu’au moment de l’utiliser (jusqu’à 15 heures plus tard) et procéder comme indiqué. Pour éviter la formation de bulles dans le support, mélangez soigneusement à l’aide du barreau d’agitation magnétique ; Des bulles à la surface de la gélose empêcheront même l’essaimage.
      NOTE: Pour d’autres essais, ajouter à cette étape, au besoin, des composants sensibles à la chaleur qui ne peuvent pas être lavés à l’autoclave, tels que des nutriments ou des colorants supplémentaires (p. ex., 8 μl de colorant Invitrogen Syto 63 par 100 ml de gélose fondue pour imager M. xanthus, comme le montrent les résultats représentatifs ci-dessous). L’ajout de certains colorants peut affecter le comportement d’essaimage de base, qui doit être vérifié par rapport à un témoin sans colorant.
   5. Dans une hotte de laboratoire, aliquote 7,5 ml de milieu stérile par boîte de Pétri en polystyrène de 60 mm de diamètre et maintenir les plaques en une seule couche (non empilées). Pour une plus grande surface d’essaimage, aliquote 25 ml de média par boîte de Pétri de 100 mm de diamètre. Il est important de remplir la vaisselle sur une surface horizontale uniforme. Utilisez un niveau d’œil de bœuf pour vérifier si la surface est nivelée.
      NOTE: Pour les dosages de P. aeruginosa , l’utilisation d’un volume de milieu spécifique par plaque améliorera l’uniformité et la reproductibilité. Pour les dosages de B. subtilis et de M. xanthus , le coulage manuel donne des résultats comparables à ceux des aliquotes de volume spécifique.
2. Durcissement des plaques
   1. Pour les petites plaques (60 mm), laisser durcir le milieu gélosé fondu (à la fois réglé sur l’excès de liquide semi-solide et sec) dans la hotte à découvert (c’est-à-dire sans couvercles) pendant 30 min. Les plaques plus grandes (100 mm) nécessitent un temps de durcissement plus long (voir Discussion).
      NOTE: Par ailleurs, certains tests peuvent nécessiter que les plaques durcissent sur la paillasse pendant la nuit (20 à 24 heures) couvertes (c.-à-d. couvercles) en une seule couche (tableau 1). L’essaimage est sensible à la fois à l’humidité excessive et insuffisante. L’humidité, le débit d’air et la température d’un laboratoire donné peuvent nécessiter une variation du durcissement des plaques pour favoriser un essaimage optimal de votre bactérie.
   2. Inoculez les plaques immédiatement après la fin de la période de séchage. Ne rangez pas les plaques pour une utilisation ultérieure.
      1. Effectuez le « test de propagation de l’encre » en repérant une plaque de test avec un mélange de 10 μl d’encre de Chine noire imperméable Higgins à 0,50 % (vol/vol) et d’inoculum bactérien. Si le mélange d’encre et d’inoculum s’étale facilement (c.-à-d. qu’il ne conserve pas la forme des gouttelettes) à la surface du support, celui-ci aura besoin de plus de temps pour sécher.
         NOTE: Pour les espèces particulièrement sensibles à l’humidité (p. ex. P. aeruginosa), effectuez un rapide « test d’étalement de l’encre » pour déterminer si les plaques sont suffisamment sèches.
3. Inoculation par essaim
   1. Inoculer 6 ml de milieu de culture en bouillon (voir le tableau 1 pour plus de détails) avec une colonie isolée d’une culture sur plaque de bouillon de lysogénie fraîche (< 5 jours si laissée à température ambiante). Incuber les cultures de bouillon pendant la nuit (≤18 heures) à 30 °C ou 37 °C en secouant horizontalement (240 tr/min).
   2. Inoculez des plaques d’essaim en les faisant tremper avec 1 à 5 μl de culture de bouillon pendant la nuit, ou en « piquant » la gélose avec un cure-dent stérile ou une aiguille d’inoculation métallique.
      NOTE: Nous préférons cette dernière méthode car elle diminue la probabilité d’éclabousser l’inoculum et empêche l’ajout d’humidité supplémentaire à la surface de l’essaim.
4. Incubation du test en essaim
   1. Pour un essai général, incuber des plaques d’essai en essaim à 30 °C ou 37 °C (ou même 42 °C pour B. subtilis ; Tableau 1) – il s’agit d’une bactérie spécifique. Retournez les plaques pendant l’incubation afin que l’excès d’humidité se condense sur le couvercle, et non sur l’agar-agar.
      NOTE: La température peut affecter le phénotype et la cinétique. Pour les essaims de P. aeruginosa , l’incubation à 37 °C entraîne une croissance et une expansion de l’essaim plus rapides qu’une incubation à 30 °C ; Cependant, la morphologie de ces essaims diffère souvent avec ce changement de température.
   2. Pour l’imagerie en accéléré, incubez les plaques d’essaim à la température appropriée avant de les transférer à la station d’imagerie (voir le tableau 1 pour plus de détails).
      NOTE: Cette incubation de pré-imagerie permet aux essaims de commencer leur développement et de s’établir avant d’être déplacés vers un nouvel environnement, qui peut ou non être optimal pour la motilité de l’essaimage.

2. Imagerie macroscopique des tests de motilité de surface

1. Pour l’imagerie en accéléré, après la période d’incubation de pré-imagerie, placez les plaques d’essai en essaim sur une plaque d’imagerie transparente à l’intérieur d’une station d’imagerie in vivo commerciale. Imagez jusqu’à six plaques de 60 mm de diamètre ou quatre plaques de 100 mm de diamètre à la fois. Étant donné que la caméra capture des images sous le plan d’imagerie, inversez les plaques afin que le chemin optique ne soit pas obstrué. Vous pouvez également incuber à 30 °C ou 37 °C (tableau 1) pendant la durée de l’expérience et retirer les plaques à imager de l’incubateur à des intervalles de temps définis.
2. Placez les couvercles des boîtes de Pétri à la verticale sur la plaque qui contient le milieu inoculé. Remplissez les couvercles des boîtes de Pétri avec de l’eau pour éviter un dessèchement excessif pendant l’imagerie, et enfermez l’ensemble à l’aide d’un autre plateau transparent pour maintenir l’humidité tout au long de l’expérience.
3. À l’aide d’un logiciel d’imagerie moléculaire (IM), effectuer des tests à température ambiante en utilisant les paramètres d’imagerie décrits dans le tableau 2. Pour l’imagerie en accéléré, mettez en place un protocole avec les étapes et les spécifications nécessaires.

Tableau 1 : Spécifications pour la préparation du dosage de la motilité de surface. Comprend les spécifications de préparation des essais de motilité de surface pour P. aeruginosa, B. subtilis et M. xanthus.

	P. aeruginosa	Études de formation des vrilles de P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus
Milieu de culture de bouillon pendant la nuit	FAB plus 30 mM Glucose	FAB plus 30 mM Glucose	LB	CTT (milieux complexes)
Température d’incubation de la culture en bouillon pendant la nuit	37 °C	37 °C	37 °C	30 h à 30 °C
Médias en essaim	FAB	FAB moins (NH4)2SO4	2 % (poids/vol) LB	CTT
Média d’essaim : composants supplémentaires	12 mM de glucosea	10 % (poids/vol) d’acides aminés (CAA), 12 mM de glucosea	n/a	SYTO® 64a
Type d’agar	Agar, Noble	Agar, Noble	Gélose granulée	Agar, Noble Affymetrix
Concentration de gélose (poids/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Taille de la plaque d’essaim	60 millimètre	60 millimètre	100 millimètre	150 millimètre
Volume de support par plaque	7,5 ml	7,5 ml	Coulé à la main	Coulé à la main
Méthode de réglage/séchage des milieux en essaim	Capot; assiettes découvertes	Capot; assiettes découvertes	Plaques de paillasse couvertes	Plaques de paillasse couvertes
Réglage/temps de séchage du support d’essaim	Durée : 30 minutes	Durée : 30 minutes	Nuit (20 -24 h)	Nuit (20 -24 h)
Température d’incubation du test d’essaim	30 ou 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Incubation pour l’imagerie time-lapse	30 °C pendant au moins 4 h	30 °C pendant au moins 4 h	37 °C pendant 2 h	RT pendant 12 h
Durée de capture en accéléré	24 h	24 h	10 h	66 h
Réglage time-lapse	1 image/10 min	1 image/10 min	1 image/6 min	1 image/10 min
a Ajouté après l’autoclavage.

 

Tableau 2 : Spécification de l’imagerie. Spécifications de la station d’imagerie Bruker pour l’imagerie par fluorescence et luminescence rouge et verte de la croissance bactérienne à la surface.

Signal	Fluorescence verte	Fluorescence rouge I	Fluorescence rouge II	Luminescence
Protéine ou colorant	Protéine fluorescente verte (GFP)	Protéine de cerise ou coloration au rhamnolipide rouge du Nil	SYTO® 64	Luciférase de l’opéron lux
Longueur d’onde d’excitation (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	De
Longueur d’onde d’émission (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Pas de filtre
Temps d’exposition (sec)	30	60	60	240
F-stop	4.0	4.0	2.5	1.1
Champ de vision (mm)	190	190	140	120
Plan focal (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Regroupement (pixels)	Aucun	2 x 2	Aucun	8 x 8

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réacteursa :
Média minimal FAB :				Préparez-vous toutes les ~4 semaines. De haut à 1 L avec nanopure H2O.
(NH4)deuxDONC4	Sigma	A4418	2 grammes	Non utilisé dans les études de formation de vrilles de P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 grammes
KH2PO4	Sigma	Réf. P5655	3 grammes
NaCl	BDH	BDH8014	3 grammes
Solution de MgCl2 x 6H2O (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
Solution de CaCl2 x 2H2O (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
Solution de métaux traces (voir ci-dessous)	n/a	n/a	1 ml
Solution de métaux traces :				Couvrir à 1 L avec nanopure H2O. Maintenir dans une bouteille en verre, en remuant et recouvert d’une feuille d’aluminium.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	Référence M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	Réf. C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Réf. Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Réf. C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
Médias CTT :				Préparez-vous au besoin. Monter à 100 ml avec nanopure H2O.
Tris-HCl, solution 1 M (ajuster au pH 8,0)	Amresco	234	1 ml	Préparez une solution mère de 1 M dans du H2O nano pur. Ajustez le pH à 8,0 et filtrez la stérilisation (pores de 0,2 μm).
K2HPO4, 1 M solution (ajuster au pH 7,6)	Sigma-Aldrich	Réf. P3786	0,1 ml	Préparez une solution mère de 1 M dans du H2O. Ajustez le pH à 7,6 et filtrez la stérilisation (pores de 0,2 μm).
Solution de MgSO4	Fisher Scientific	M65	0,8 ml	Préparer une solution mère de 1 M dans du H2O. Stériliser par filtre (pores de 0,2 μm).
Casitone	BD Diagnostics	225930	1 g
Réactifs supplémentaires :
Bouillon LB, Lennox	BD Diagnostics	240230	2 % (en poids/vol)
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich	Référence G5767	30 mM pour les cultures en bouillon pendant la nuit ; 12 mM pour les supports en essaim	Préparez une solution mère stérilisée avec filtre de 1,2 M dans du H2O. nano pur. Ajouter au média après l’autoclavage.
Acides aminés (CAA)	Amresco	J851	0,10 % (poids/vol)	Recommandé pour les études de formation des vrilles de P. aeruginosa . Ajouter au milieu avant l’autoclavage.
Agar, Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0,45 % (poids/vol)	Gélose noble préférée pour les études de motilité de surface de P. aeruginosa . Ajouter au milieu avant l’autoclavage.
Agar, Noble	Affymetrix	10907	1,50 % (poids/vol)	Utilisé dans les études de motilité de surface de M. xanthus . Non recommandé pour les études de motilité de P. aeruginosa . Ajouter au milieu avant l’autoclavage.
Agar, granulé	Fisher Scientific	BP1423	0,60 % (poids/vol)
Encre de Chine noire imperméable Higgins	Higgins	HIG44201	0,50 % (vol/vol)	Mélangez de l’encre avec de l’inoculum pour tester l’humidité de surface du support d’essaim.
Colorant d’acide nucléique fluorescent rouge SYTO® 64	Invitrogen	Réf. S-11346		Utiliser 4 μl (pour P. aeruginosa) ou 8 μl (pour M. xanthus) de SYTO® 64 pour 100 ml de gélose fondue (ajoutée après autoclavage).
Matériaux et équipements pertinents :
Boîte de Pétri, stérile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)	VWR	25384-326
Boîte de Pétri, stérile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)	VWR	25384-342
Boîte de Pétri, stérile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker			Utilisation pour l’imagerie macroscopique des études de motilité de surface. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html