Microscopie à contraste de phase pour l’évaluation des mutants développementaux chez les streptomyces

Abstract

Source : Bennett, J. A. et al. Évaluation visuelle et microscopique des mutants développementaux de Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie à contraste de phase pour examiner les différences phénotypiques entre Streptomyces coelicolor de type sauvage et mutant. Il décrit les étapes de la préparation et de l’imagerie des filaments aériens pour détecter les défauts de développement dans la formation des spores.

Protocol

1. Effectuer une microscopie à contraste de phase

1. Stérilisez la pince à épiler en la lavant dans de l’éthanol à 70 %, puis en la passant à travers une flamme de bec Bunsen pour évaporer l’éthanol. Laisser refroidir.
2. Stérilisez les lamelles en les lavant dans de l’éthanol à 70 %, puis en les laissant sécher dans une boîte de Pétri stérile.
3. Préparez un soulèvement de la croissance bactérienne à examiner.
   1. Prenez une lamelle stérile à l’aide d’une pince à épiler stérile et placez-la sur une plaque de gélose à base de farine de soja (MS) où la croissance bactérienne de Streptomyces coelicolor est dense. Appuyez doucement sur l’arrière de la lamelle à l’aide d’une pince à épiler pour assurer un transfert suffisant des spores bactériennes et du mycélium aérien.
4. Prenez la lamelle de la plaque et placez-la de manière à ce que le côté avec le matériau cellulaire soit orienté vers la surface d’une lame de microscope, avec une goutte de 15 μL de glycérol à 50 % préparée dans de l’eau pour le montage. Réduisez les bulles d’air en plaçant la lamelle à un angle de 45° par rapport à la glissière et en la laissant tomber sur le glycérol à 50 %.
5. (Facultatif) Sceller avec du vernis à ongles transparent pour la conservation de la lame.
6. Effectuez la microscopie à contraste de phase à différents intervalles de temps au cours du cycle de vie.
   NOTE: L’imagerie répétée permet une analyse plus complète et la capacité de détecter les retards de développement. Répétez les observations indépendamment pour garantir l’exactitude et la reproductibilité.
   1. Placez la lame préparée sur la platine du microscope et ajoutez une goutte d’huile d’immersion au centre de la lamelle. Faites pivoter l’objectif de phase 100X en place et réglez la tourelle du condenseur sur le réglage de phase « correspondant ». Faites la mise au point de l’image à l’aide uniquement du bouton de réglage fin une fois que l’objectif est en contact avec l’huile.
   2. Examinez plusieurs champs de vision pour discerner des différences notables et constantes entre les souches mutantes et le type sauvage, telles que la capacité de former des spores, la taille et la forme des spores et le nombre total de spores (voir la figure 1).
      NOTE: Les alternatives à la microscopie à contraste de phase comprennent la microscopie à contraste interférentiel différentiel (CID) et des techniques de coloration simples à utiliser avec des microscopes à fond clair, telles que la coloration violette cristalline.

Results

Figure 1 : Micrographies à contraste de phase montrant un filament aérien représentatif des souches mutantes blanches de Streptomyces coelicolor contenant des mutations aléatoires d’insertion de transposons.

Materials