Etablissement d’une culture binaire de saccharibactéries avec des bactéries hôtes

Résumé

Source : Collins, A. J., et al., Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques à partir de la cavité buccale. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’établissement et le maintien d’une culture binaire de Saccharibacteria et de sa bactérie hôte en les co-incubant séquentiellement dans un milieu de croissance spécifique à l’hôte.

Protocole

1. Concentrer les cellules de Saccharibacteria par centrifugation
   1. Faites une marque d’orientation sur le tube et le bouchon, et placez le tube dans une centrifugeuse à grande vitesse avec la marque sur la face supérieure. Le granulé formé par centrifugation est généralement invisible. Le marquage aidera à déterminer où se trouve la pastille de cellules de Saccharibacteria lorsque la centrifugation est effectuée et que le tube est retiré de la centrifugeuse.
   2. Centrifuger les échantillons à 60 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
      NOTE: Cette force et ce temps sont suffisants pour granuler toutes les cellules de Saccharibacteries. Cependant, les cellules de Saccharibacteria peuvent être au moins partiellement granulées par centrifugation pendant aussi peu que 20 minutes à 20 000 x g.
   3. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse. Versez le liquide du tube, en gardant la pastille sur la face supérieure du tube.
   4. Remettez en suspension la pastille habituellement invisible dans 1 à 2 mL de tampon MRD (diluant de récupération maximale) par vortex vigoureux.

2. Infecter les cultures hôtes avec un filtrat enrichi en Saccharibactéries

1. Préparez des tubes de culture en aliquotant 2 mL de milieu de croissance approprié (p. ex., TSBY (bouillon de soja tryptique avec 0,1 % d’extrait de levure), BHI (infusion cerveau-cœur), etc.) dans les tubes.
2. Ajouter 200 μL de la culture nocturne d’organismes hôtes dans chaque tube. Ajouter 100 à 200 μL d’échantillon filtré remis en suspension dans chaque tube.
3. Incuber des échantillons combinés en fonction de l’organisme hôte (p. ex., 37 °C, dans une atmosphère aérobie pour Arachnia propionica).
4. Passage des cellules tous les deux à trois jours en transférant 200 μL de culture binaire dans 2 mL de milieu de croissance frais dans un tube neuf. S’il semble que les cultures passées ne montrent aucune croissance (c.-à-d. que la turbidité/densité optique de la culture n’augmente pas après le passage dans un milieu frais), les Saccharibacteria pourraient submerger ou tuer tous les organismes hôtes. Pour y remédier, ajoutez 200 μL de culture hôte non infectée lors du passage des cellules. Répétez l’opération pendant au moins 5 passages.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon d’infusion Brain Heart (poudre déshydratée)	Becton-Dickinson	211059	Ou d’autres milieux de croissance adaptés aux organismes cibles
Rotor de centrifugeuse 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 Boîte à gants Control InVitro	Laoratoires timides	31615	Si nécessaire pour les organismes microaérobies
Centrifugeuse haute vitesse Optima L-100 XP	Beckman Coulter	8043-30-1124
Micro pipette P-1000	Gilson	F123601G
Micro-pipette P-200	Gilson	F123602G
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Fisher Scientific	BP399500
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Pointes de pipette - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Pointes de pipette - 200 μL	Fisher Scientific	02-717-165
Tubes à centrifuger coniques à bouchon à vis 15 mL	Faucon	352096	Ou autre tube adapté à la culture bactérienne
Tubes à centrifuger en polycarbonate à paroi épaisse de 25 x 89 mm (capacité de 26,3 ml) avec bouchons	Beckman Coulter	355618
Plaques d’agar-gélose au sang de soja tryptique	Services de laboratoire du Nord-Est	P1100	Ou une autre plaque de gélose suffisante pour la croissance des organismes hôtes
Bouillon de soja tryptique (poudre déshydratée)	Becton-Dickinson	211825	Ou d’autres milieux de croissance adaptés aux organismes cibles
Extrait de levure	Fisher Scientific	Réf. BP1422-500