Sous-culture de bactéries anaérobies sulfito-réductrices à partir d’une culture de gélose

Résumé

Source : Anwar, Z., et al. Enrichissement et détection des toxinotypes de Clostridium perfringens dans des échantillons d’aliments vendus au détail. J. Vis. Exp. (2019).

Dans cette vidéo, les bactéries sulfito-réductrices sont cultivées dans un milieu gélosé contenant des sulfites, où elles se développent en anaérobie et réduisent le sulfite en sulfure d’hydrogène, formant des précipités noirs avec des ions fer. Les colonies noires sont isolées à partir de la profondeur de la gélose à l’aide de techniques aseptiques et transférées dans un milieu frais pour une incubation anaérobie continue.

Protocole

REMARQUE : Clostridium perfringens est considéré comme un organisme de niveau de danger pour la biosécurité 2 (BSL2). Bien que tous les échantillons d’aliments ne contiennent pas de C. perfringens, tous les échantillons cultivés doivent être traités comme tels. Toutes les précautions appropriées et l’équipement de protection individuelle (EPI) doivent être portés en tout temps. Décontaminer tout le matériel avant de l’éliminer.

1. Préparez le RPM modifié (milieu de perfringens rapide)

1. Mélanger 30 g/L de thioglycolate fluide, 60 g/L de gélatine, 5 g/L de peptone, 5 g/L de glucose, 5 g/L de phosphate dibasique de potassium, 3 g/L d’extrait de levure, 1,5 g/L de chlorure de sodium, 0,5 g/L de sulfate ferreux dans de l’eau désionisée jusqu’à ce qu’ils soient uniformément dispersés. Nous fabriquons généralement des lots de 1 L.
2. Autoclave à 121 °C pendant 15 min.
3. Laisser refroidir à environ 40 °C.
4. Une fois que le régime est refroidi, ajouter de la D-cyclosérine à une concentration finale de 440 mg/L.
   NOTE: Les concentrations de base de D-cyclosérine dissoute dans de l’eau stérile à 50 mg/mL peuvent être entreposées à -20 °C pour une utilisation future.
5. Transférez de manière aseptique 10 ml de régime dans des tubes coniques de 15 ml. Les tours par minute peuvent être préparés par lots et conservés à 4 °C pendant un mois maximum.
6. Chauffer à 37 °C avant utilisation.

2. Prélèvement d’échantillons et incubation RPM

1. Transportez les aliments au laboratoire à température ambiante dans un délai de 1 h. Les aliments peuvent être transportés dans leur emballage d’origine ou dans des contenants stériles. S’ils ne sont pas testés immédiatement, les aliments peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à leur utilisation. Le cas échéant, notez le type d’aliment et le pays d’origine selon l’étiquette de l’emballage, ainsi que toute autre information pertinente.
2. Prélever environ 1,0 à 2,0 g de nourriture et transférer dans une boîte de Pétri stérile ou équivalent. Hacher finement avec une lame de rasoir stérile ou un scalpel.
3. Inoculer dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube conique de 15 mL. Bien mélanger.
   1. Pour sélectionner les cellules végétatives, transférez 5 mL du mélange PBS-aliments dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de RPM. Fixez bien le couvercle.
   2. Pour sélectionner les spores, chauffer les 5 mL restants du mélange PBS-aliments à 85 °C pendant 15 minutes, puis transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de tr/min. Fixez bien le couvercle.
4. Vortex et inverser les cultures de RPM alimentaires pour assurer un mélange complet.
5. Fermez hermétiquement les tubes coniques et enveloppez les couvercles d’un film de paraffine ou d’une pellicule plastique pour assurer un environnement anaérobie.
6. Incuber toute la nuit (ON) à 37 °C.
7. Le lendemain matin, notez toute turbidité ou fermentation dans les tubes RPM.

3. Placage « sandwich » TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine)

1. Inoculer des cultures d’ON RPM dans une gélose TSC à l’aide d’une technique « sandwich » (figure 1) décrite ci-dessous.
2. Préparez la gélose TSC selon les instructions du fabricant.
   1. Préparez la couche de base des plaques TSC en transférant 10 ml de gélose TSC fondue dans des boîtes de Pétri stériles et laissez se solidifier. Ceux-ci peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 °C. Assurez-vous que les plaques sont chauffées à température ambiante avant de les utiliser.
   2. Pour la couche supérieure de la plaque TSC, maintenez la gélose TSC fondue restante à 40 °C.
      NOTE: Bien que le point de fusion de l’agar soit supérieur à 85 °C, la gélose fondue se solidifie autour de 32 à 45 °C.
3. Récupérez soigneusement les cultures ON RPM et transférez 100 μL dans la base de gélose TSC. En raison de la fermentation, certaines cultures peuvent être sous pression. Assurez-vous de porter tous les EPI appropriés.
4. Étalez l’inoculum RPM à l’aide de billes de verre stérilisées ou d’un épandeur de cellules.
5. Laisser le RPM être « absorbé » dans la gélose TSC pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
6. Transvaser soigneusement 20 mL de gélose TSC fondue à 40 °C sur une plaque à l’aide d’une pipette sérologique.
7. Replacez le couvercle de la boîte de Pétri et laissez la gélose TSC se solidifier complètement à température ambiante.
8. Retournez la boîte de Pétri et incubez à 37 °C ON.
9. Si des dilutions en série sont souhaitées, effectuer des dilutions des cultures de RPM ON dans des RPM frais et préchauffés avant l’inoculation dans la gélose TSC.

4. Sous-culture de colonies sulfito-réductrices

1. Le lendemain matin, retirez les plaques de l’incubateur et examinez la croissance bactérienne. Des bactéries aérobies peuvent être présentes à la surface de la gélose. Les bactéries anaérobies se développent incrustées dans la gélose. Les bactéries réductrices de sulfites deviendront noires pour la gélose environnante. Les colonies possibles de C. perfringens seront noires et noyées dans la gélose.
2. Les colonies suspectées de C. perfringens seront positives pour la réduction des sulfites et apparaîtront noires, incrustées dans la gélose. À l’aide d’un compte-gouttes stérile à usage unique, « épiler » les colonies noires de la gélose et les transférer à 10 ml de RPM frais dans un tube conique de 15 ml. Il est important que l’air de la pipette soit expulsé avant de percer la gélose.
3. S’il y a une quantité dense de croissance bactérienne aérobie à la surface de la plaque, utilisez un grattoir à cellules stériles pour retirer les colonies des zones sélectionnées. Plusieurs colonies suspectées de C. perfringens peuvent être échantillonnées à partir de la même plaque TSC dans des cultures RPM distinctes.
4. Fixez hermétiquement les couvercles des tubes coniques et enveloppez-les dans un film de paraffine ou une pellicule plastique. Incuber à 37 °C.

Résultats

Figure 1 : Schéma de la technique du sandwich de gélose TSC.

Les milieux RPM contenant la bactérie C. perfringens sont placés entre deux couches de gélose TSC afin de favoriser un environnement anaérobie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
D-cyclosérine	Sigma-Aldrich	Réf. C6880
Dextrose	Sigma Sciences de la Vie	D9434-250G
Pipettes de transfert jetables	n’importe quelle marque		Choisissez-en un avec une pointe mince comme les pipettes de transfert jetables Thermo Scientific 137116M/EMD
Kits de sang et de tissus DNeasy	Qiagen	69504	Remarque : de nombreux kits d’extractions d’ADN et de plasmides ont été évalués, ce kit a donné les résultats les plus souhaitables.
Incubateur sec	n’importe quelle marque
Milieu thioglycolate fluide	Remel	R453452
Gélatine de peau de porc	Sigma Sciences de la Vie	G1890-500G
Sulfate de fer (II) heptahydraté	Sigma Sciences de la Vie	F8633-250 G
Lysozyme à partir du blanc d’œuf de poule	Sigma-Aldrich	L6876	Nécessaire pour l’extraction de l’ADN, non fourni dans le kit
Parafilm ou pellicule plastique	n’importe quelle marque
Peptone de caséine et d’autres protéines animales	Sigma-Aldrich	Référence 70173-100G
Base de gélose Perfringens (TSC + SFP)	Oxoïde	CM0587	Faire de la gélose TSC selon les instructions
Phosphate de potassium dibasique	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S-7653
Racleur de cellules stériles	n’importe quelle marque
Épandeur de cellules stériles	n’importe quelle marque
Boîtes de Pétri stériles	n’importe quelle marque
Extrait de levure	Sigma-Aldrich	Référence 70161-100G