Séparation par chromatographie sur couche mince de nucléotides (p)ppGpp isolés de bactéries induites par le stress

1. Chromatographie sur couche mince
   1. À l’aide d’un crayon doux, tracez une ligne d’origine à 1 cm du bord de la plaque de chromatographie sur couche mince (CCM) en polyéthylénimine-cellulose (PEI-cellulose) de 20 cm x 20 cm dont on a retiré 5 cm par le haut à l’aide de ciseaux. Appliquer 5 μL sous forme de gouttelettes sur la surface de l’Île-du-Prince-Édouard pour chaque échantillon. Commencez le développement ascendant sans laisser cet endroit sécher, ce qui améliore la résolution en minimisant les stries.
   2. Effectuer un développement ascendant dans un réservoir avec une couche de solution de 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) suffisamment peu profonde pour que le liquide ne touche pas le point d’origine de l’échantillon. Couvrez le réservoir d’un joint étanche à l’air et laissez le liquide remonter vers le haut de la feuille coupée, 15 cm. Pour atteindre un pH de 3,4 pour une solution de 1,5 M KH₂PO₄ , il est nécessaire d’ajuster le pH en ajoutant H₃PO₄.
   3. Retirez le chromatogramme complètement développé et séchez-le à l’air libre à température ambiante.
   4. Coupez et jetez la partie supérieure (pH avant) du chromatogramme contenant le ³²P libre dans les déchets radioactifs. Cette partie est représentée en jaune sur la figure 1 et est facilement visualisable sous la lumière UV. Si l’on ne mesure que des nucléotides (p)ppGpp qui migrent plus lentement que la guanosine triphosphate (GTP), il est recommandé d’appliquer un étalon GTP UV-visible, puis de couper et de jeter une partie supérieure plus grande (tout ce qui est supérieur au GTP, comme le montre la figure 1).
   5. Exposez les films autoradiographiques pendant la nuit avec un écran au phosphore.
   6. Développer le film. Capturez et quantifiez le signal de l’écran au phosphore à l’aide d’un phosphoimageur.
       
2. Quantification de la (p)ppGpp
   1. Quantifiez les taches radioactives avec l’image J.
      NOTE: La quantité de (p)ppGpp peut être normalisée en fonction de la quantité totale de nucléotides G observée dans chaque échantillon (Figure 1). Si la quantité d’arrière-plan est homogène, un seul blanc (encadré 4 de la figure 1) peut être soustrait pour corriger l’arrière-plan. Le total G est la somme de GTP + ppGpp + pppGpp détectés. Cette normalisation suppose que les taux de guanosine monophosphate (GMP) et de guanosine diphosphate (GDP) sont négligeables, ce qui est vrai pour Escherichia coli. Le rapport d’un nucléotide donné au G total constitue un moyen important de corriger les variations du volume d’échantillon appliqué.

Figure 1 : Analyse représentative de la CCM. Représentation schématique des résultats obtenus après autoradiographie et criblage au phosphore pendant la nuit avec le CCM. Les taches à mesurer sont indiquées en rouge. La formule de calcul du montant fractionnel de ppGpp est également illustrée. Le total G fait référence à la quantité totale de GTP + ppGpp + pppGpp détectée dans l’échantillon. La bande jaune représente le front de pH visible sous la lumière UV. Les ciseaux indiquent où nous recommandons de couper le chromatogramme pour éliminer la majeure partie de la radioactivité. La flèche indique la direction de l’écoulement lors du développement ascendant avec un tampon phosphate de 1,5 M