Culture unicellulaire de bactéries dans des vésicules géantes

Résumé

Source : Morita, M., et al. Culture cellulaire bactérienne au niveau de la cellule unique à l’intérieur de vésicules géantes. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente une méthode de culture et d’observation de cellules bactériennes individuelles encapsulées dans des vésicules géantes ancrées à une bicouche lipidique soutenue. Le système permet une imagerie stable et à long terme de la dynamique de croissance d’une cellule unique dans un microenvironnement confiné et physiologiquement pertinent.

Protocole

1. Préparation d’un système d’observation de vésicule géante (GV) (Bacterial Cell Culture System)

1. Préparation de petites vésicules (SV) pour la construction d’une membrane bicouche supportée
   1. Verser 20 μL de la solution de POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) et 4 μL de la solution de biotine-PEG-DSPE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000) dans un tube de verre.
   2. Évaporez le solvant organique par flux d’air pour former un film lipidique et placez cet échantillon dans un dessiccateur pendant 1 h pour évaporer complètement le solvant organique.
   3. Ajouter 200 μL de glucose à 200 mM dans 1 milieu LB (bouillon Luria-Bertani) (la solution aqueuse externe des GV) dans le flacon en verre.
   4. Enveloppez la partie d’ouverture du flacon en verre avec un film et faites-le soniser dans un bain à ultrasons (120 W) pendant au moins 1 h.
   5. Préparez les SV par la méthode d’extrusion à l’aide d’une mini-extrudeuse et d’une membrane en polycarbonate avec une taille de pores de 100 nm.
2. Préparation d’une chambre faite à la main
   1. Percez un trou de 7 mm à l’aide d’un poinçon creux sur un joint double face (10 mm x 10 mm x 1 mm).
   2. Collez le joint double face avec le trou sur un verre de protection (30 mm x 40 mm, épaisseur 0,25–0,35 mm).
3. Préparation d’une membrane bicouche supportée sur le verre de couverture dans le trou de la chambre
   1. Ajouter 30 μL de la solution SV dans le trou de la chambre (préparé à la section 2.2) et incuber à RT pendant 30 min.
   2. Lavez doucement le trou deux fois avec 20 μL de milieu 1x LB contenant 200 mM de glucose (la solution aqueuse externe des GV) par pipetage.
4. Immobilisation des GV sur la membrane bicouche supportée sur le verre de couverture dans le trou de la chambre
   1. Introduire 10 μL de neutravidine avec la solution aqueuse externe de GV (1 mg/mL) dans le trou et incuber à RT pendant 15 min.
   2. Lavez doucement le trou deux fois avec 20 μL de milieu 1x LB contenant 200 mM de glucose (la solution aqueuse externe des GV) par pipetage.
   3. Ajouter toute la solution contenant des GV dans le trou de la chambre et sceller avec un verre de protection (18 mm x 18 mm, épaisseur 0,13 à 0,17 mm) (figure 1b).
5. Observation microscopique de la croissance cellulaire bactérienne à l’intérieur des GV
   1. Réglez un système de platine de chauffage microscopique à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un objectif à ouverture numérique (NA) 40x/0,6 avec une longue distance de travail (Figure 1b).
   2. Placez la chambre sur le système d’étage de chauffage microscopique (Figure 1b). Incuber les GV contenant des cellules bactériennes dans la chambre dans des conditions statiques pendant 6 h à 37 °C.
   3. Capturez et enregistrez des images microscopes de la croissance des cellules bactériennes à l’intérieur des GV toutes les 30 minutes à l’aide d’une caméra scientifique à semi-conducteurs à oxyde métallique complémentaire (sCMOS).

Résultats

Figure 1 : Le système d’observation de la culture cellulaire bactérienne à l’intérieur des GV. (a) Les GV sont immobilisés sur une membrane supportée par la liaison biotine-neutravidine sur le verre de couverture. Les GV son...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bactotryptone	BD Biosciences	211705
Chloroforme	Produits chimiques purs Wako	032-21921
Verre de protection (18 × 18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	Epaisseur 0,13–0,17 mm
Verre de protection (30 × 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	sur mesure	Epaisseur 0,25–0,35 mm
Centrifugeuse de bureau	Compagnie Hi-Tech	ATT101	Type de rotor pivotant
Joint double face (10 × 10 × 1 mm)	Les Nitoms	Réf. T4613
Glucose	Produits chimiques purs Wako	049-31165
Microscope inversé	Olympe	IX-73
Méthanol	Produits chimiques purs Wako	133-16771
Système d’étage de chauffage microscopique	SUCCÈS DE TOKAI	TP-110R-100 (en anglais)
Huile minérale	Nacalai Tesque	23334-85
Neutravidine	Thermo Fisher Scientific	31000
Lentille d’objectif	Olympe	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membranes en polycarbonate	Lipides polaires Avanti	610005
Caméra sCMOS	Andor	Zyla 4.2 plus	Taille des pores 100 nm
Chlorure de sodium	Produits chimiques purs Wako	191-01665
Saccharose	Produits chimiques purs Wako	196-00015
Bain à ultrasons	COMME UN	ASU-3D
Extrait de levure	BD Biosciences	212750
Tube en plastique à couvercle de 0,6 mL	Watson	130-806C
Tube en plastique de 1,5 mL avec couvercle	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocoline	Lipides polaires Avanti	Référence 850457P
1,2-distéaroyl-snglycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[biotinyl(polyéthylèneglycol)-2000]	Lipides polaires Avanti	Référence 880129P	POPC
			Biotine-PEG-DSPE