Étude de la réponse bactérienne à l’éthylène à l’aide d’un composé libérant de l’éthylène

Résumé

Source : Augimeri, R. V. et al., Utilisation du composé libérant de l’éthylène, l’acide 2-chloroéthylphosphonique, comme outil pour étudier la réponse de l’éthylène chez les bactéries. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre l’effet de l’éthylène généré par l’acide 2-chloroéthylphosphonique (CEPA) sur la croissance bactérienne et la production de cellulose. L’éthylène active les voies de signalisation qui stimulent la synthèse de la cellulose, ce qui améliore la formation des pellicules. Ces résultats mettent en évidence la réponse bactérienne à l’éthylène.

Protocole

1. Dosages de pellicule
   1. Cultiver et quantifier des cultures de démarrage de Komagataeibacter xylinus en trois exemplaires :
      1. En trois exemplaires, inoculer une seule colonie de Komagataeibacter xylinus dans 5 ml de milieu Schramm et Hestrin (SH) (pH 5) complété par 0,2 % (v/v) de cellulase stérilisée par filtre. Incuber les cultures à 30 °C avec agitation à 150 tr/min jusqu’à ce qu’une densité optique à 600 nm (DO₆₀₀) de 0,3 à 0,4 soit atteinte (environ 72 h).
      2. Récolter les cultures de démarrage par centrifugation (2 000 x g ; 4 °C ; 10 min). Lavez les cellules deux fois avec 5 ml de solution saline stérile et remettez en suspension la pastille cellulaire. Gardez les cellules sur de la glace.
      3. Quantifiez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de Petroff-Hausser.
   2. Préparez les Master Mixes pour inoculer des plaques à 24 puits :
      1. Compléter 60 ml de milieu SH (pH 7) avec 120 μl de stocks d’acide 2-chloroéthylphosphonique 5, 50 et 500 mM (CEPA) pour obtenir des concentrations finales de 0,01, 0,1 et 1,0 mM, respectivement. Compléter 60 ml supplémentaires de milieu SH (pH 7) avec 120 μl du solvant utilisé pour dissoudre le CEPA. Vortex à mélanger.
      2. Diviser chaque 60 ml de milieu contenant la LCPE en quatre aliquotes de 14 ml. Inoculer trois des 14 ml d’aliquotes avec des réplicats biologiques de la culture de démarrage à une concentration de 10^{à 5} cellules/ml. Gardez les tubes avec des cellules sur de la glace pour éviter la production de cellulose.
         NOTE: Les 14 ml d’aliquote restants seront utilisés pour les puits de contrôle stériles.
   3. Inoculer des plaques à 24 puits :
      1. Testez chaque traitement dans sa propre boîte avec trois rangées de répétitions biologiques et une rangée de témoins stériles (figure 1).
      2. À l’aide du mélange maître de 14 ml, ajoutez 2 ml dans chacun des six puits d’une plaque stérile à 24 puits. Complet pour les trois répétitions biologiques et le témoin stérile (figure 1). Répétez l’opération pour chaque traitement.
      3. Scellez les plaques avec un film de paraffine et incubez statiquement pendant 7 jours à 30 °C.
      4. Récoltez et mesurez le poids sec de la pellicule (rendement en cellulose) (Figure 1) :
         1. Transférez individuellement les pellicules dans les puits d’une plaque à 6 puits. Pour lyser les cellules, traitez les pellicules avec 12 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 N (NaOH) à 80 °C pendant 20 min.
         2. Éliminez le NaOH et neutralisez les pellicules en les lavant à l’eau ultra-pure pendant 24 heures avec agitation. Changez l’eau toutes les 6 heures.
            NOTE: Les pellicules doivent être blanches à la fin de l’étape de lavage.
         3. Placez les poids de la pellicule sur des tapis en silicone et séchez-les à 50 °C pendant 48 heures jusqu’à poids constant. Une fois secs, retirez-les des tapis et mesurez leur poids sur une balance analytique pour déterminer le rendement en cellulose bactérienne.

Résultats

Figure 1 : Organigramme illustrant le protocole utilisé pour le dosage et l’analyse des pellicules. Un milieu de référence à pH 7 SH (60 ml) complété par CEPA est aliquote pour trois inoculations biologiques distinctes et un témoin stérile (14 ml chacun). Ces cultures son...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921	Sigma	Réf. C2730	Solution aqueuse
Acide citrique	Boutique Bio	Référence CIT002.500	Pour le milieu SH
Éthéphon (≥ 96 % ; acide 2-chloroéthylphosphonique)	Sigma	C0143	Composé libérant de l’éthylène
Glucose	BioBasic	Référence : GB0219	Pour le milieu SH
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	Alphaprotéobactérie productrice de cellulose bactérienne
Phosphate de sodium, heptahydrate dibasique	Boutique Bio	SPD579.500	Phosphate de sodium, heptahydrate dibasique pour milieu SH
NaCl	BioBasic	Référence : SOD001.1	Chlorure de sodium pour solution saline et de contrôle
Phosphate de sodium, monobasique monohydraté	Boutique Bio	SPM306.500	Phosphate de sodium, monohydrate monobasique pour solution de contrôle
NaOH	Boutique Bio	SHY700.500	Hydroxyde de sodium pour l’ajustement du pH
Film de paraffine	Parafilm	Réf. PM996	Pour l’étanchéité des plaques et des flacons
Peptone (bactériologique)	Boutique Bio	PEP403.1	Pour le milieu SH
Chambre de comptage Petroff-Hausser	Hausser scientific	3900	Chambre de comptage de cellules bactériennes
Filtre de stérilisation en polyéthersulfone 0,2 μm	VWR	28145-501	Pour la stérilisation de la cellulase
Extrait de levure	BioBasic	G0961	Pour le milieu SH