Isolement de bactéries à Gram négatif avec des insertions de transposons génomiques

Dans cet article

Résumé

Source : Kazi, M. I., et. al., Génération de banques d’insertion de transposons chez des bactéries à Gram négatif pour le séquençage à haut débit. J . Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre la sélection, la quantification et la préservation de bactéries réceptrices à Gram négatif portant des insertions de transposons en fonction de la résistance à la kanamycine.

Protocole

Génération de la banque finale de mutants bactériens

Décongeler une aliquote de l’accouplement congelé sur de la glace.
Accouplement des plaques sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) de 150 mm complétées par de la kanamycine sur la base des unités formant colonies (UFC) calculées à l’étape 3.1. Ajustez le volume avec LB pour obtenir 13 333 colonies par 150 μL avant le placage.
NOTE: Le nombre d’UFC ici a été déterminé à environ^10,5 UFC/mL, de sorte que le volume d’accouplement a été ajusté pour obtenir 13 333 colonies par boîte. Cela permettrait d’obtenir un nombre optimal de colonies sur 30 plaques pour une bibliothèque de mutants à haute résolution sans surcharger les plaques.
À l’aide de billes de verre stériles, étalez 150 μL de dilution par boîte sur des plaques de gélose Luria-Bertani de 30 x 150 mm complétées par de la kanamycine pour obtenir 400 000 colonies (figure 1C).
NOTE: Des tiges stériles ou tout type d’outil d’épandage stérile (c’est-à-dire des billes de verre) peuvent être utilisés pour propager les bactéries sur des plaques.
Jetez le tube usagé contenant l’excès d’accouplement.
NOTE: Les cycles de congélation/décongélation ajoutent des pressions sélectives sur la culture bactérienne, ce qui peut fausser les résultats de l’expérience Tn-seq. Utilisez une aliquote fraîche à chaque fois.
Incuber les plaques à 37 °C pendant 14 h.
NOTE: Le temps d’incubation est optimisé pour éviter la prolifération (contact des colonies). Il est suggéré de minimiser la croissance en réduisant le temps d’incubation.

Estimation de la densité des bibliothèques et regroupement pour le stockage

Comptez les UFC sur chaque plaque pour estimer le nombre total de mutants dans la bibliothèque de transposons. Comptez 20 % d’au moins 3 plaques pour déterminer l’estimation du nombre de colonies pour l’ensemble du groupe de plaques (figure 2A). Assurez-vous que les colonies ne touchent pas une autre colonie.
Après avoir calculé le rendement estimé de la colonie, ajoutez 3 à 5 ml de LB (ou plus si nécessaire) dans chaque assiette et grattez les bactéries à l’aide d’un outil de grattage stérile. NOTE: Des boucles d’inoculation stériles ont été utilisées pour racler efficacement les plaques.
Regrouper les suspensions bactériennes de toutes les plaques dans des tubes coniques de 50 mL (figure 1D). Cela nécessitera plusieurs tubes coniques de 50 ml, au moins 3.
Suspension bactérienne en pool de granulés par centrifugation à 5 000 x g pendant 7 min.
Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de LB complété par 30 % de glycérol.
Aliquote 1 mL de la banque de transposons dans des cryoflacons et conserver à -80 °C.

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Résultats

Figure 1 : Schéma de construction de la bibliothèque de mutants transposons. (A) Conjugaison bactérienne. La souche « donneuse », qui code pour la machinerie de transposition, a été mélangée à la souche « réceptrice ». Le mélange a été repéré s...