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1. Transformation naturelle
NOTE: Le dérivé de N315, N2-2.1, a été utilisé comme récepteur. Dans cette souche, le locus sigH a été dupliqué de manière à exprimer constitutivement SigH. Si le marqueur de résistance à transférer n’est pas le chloramphénicol, pRIT-sigH (CmR) peut être utilisé pour exprimer SigH. Un plasmide purifié ou un extrait d’ADN entier de S. aureus COL-45 acquis par cfr est utilisé comme ADN donneur pour la transformation.
- Préparation de l’ADN du donneur
- Cultiver le COL-45 pendant la nuit, en agitant à 37 °C, dans une fiole de 300 ml contenant 50 ml de bouillon de soja tryptique (BST) complété par 32 mg/L de chloramphénicol. Culture d’E. coli HST04 portant le plasmide pHY300 (TetR) pour extraire le plasmide pour l’expérience de contrôle.
NOTE: HST04 (dam-/dcm-) n’a pas les gènes de l’ADN méthylase. D’autres souches conventionnelles avec des ADN méthylases peuvent également être utilisées pour préparer le donneur d’ADN, car l’état de méthylation de l’ADN n’affecte pas l’efficacité de la transformation. Alternativement, le plasmide pT181 purifié à partir de la souche COL de S. aureus peut également être utilisé comme témoin positif pour l’essai de transformation. - Recueillir les cellules par centrifugation (8 000 x g pendant 10 min à 4 °C).
- Extrayez les plasmides à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN plasmidique ou d’une méthode de purification d’ADN conventionnelle pour purifier l’ADN entier.
- Quantifiez l’ADN purifié à l’aide d’un spectromètre et maintenez-le à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
NOTE: Utilisez une préparation d’ADN frais pour le test de transformation, généralement datant de moins d’une semaine. Les anciennes préparations d’ADN réduisent l’efficacité de la transformation.
- Essai de transformation
- Cultiver la cellule réceptrice (N2-2.1) pendant une nuit dans 5 ml de TSB à 37 °C en agitant la question.
- Transférez 0,5 ml de la culture de nuit dans un tube de 1,5 ml. Précipiter les cellules par centrifugation (10 000 x g pendant 1 min à 4 °C).
- Suspendez les cellules avec 10 mL de milieu CS2 dans un tube de 50 ml.
NOTE: Le milieu CS2 est un milieu synthétique complet qui induit la compétence pour la transformation naturelle chez S. aureus. D’autres milieux de laboratoire standard, tels que le TSB ou la perfusion cerveau-cœur (BHI), ne conviennent pas à la transformation. - Cultivez les bactéries à 37 °C en secouant (180 tr/min) jusqu’à la fin de la phase exponentielle (environ 8 heures).
- Récoltez les cellules par centrifugation (5 000 x g pendant 5 min à 4 °C).
- Remettre les cellules en suspension dans 10 ml de milieu CS2 frais.
- Ajouter 10 μg d’ADN plasmidique ou génomique purifié (étape 1.1.4) à la suspension cellulaire. Agiter à 37 °C et 180 tr/min pendant 2,5 h.
NOTE: Des temps d’incubation plus courts avec l’ADN (<2,5 heures) entraînent des fréquences de transformation plus faibles. - Prélever les cellules par centrifugation (5 000 x g pendant 5 min à 4 °C).
- Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu BHI. Mélanger la suspension cellulaire avec 90 ml de gélose BHI fondue (55 °C) et 32 mg/L de chloramphénicol (ou 5 mg/L de tétracycline dans l’expérience de contrôle). Versez le mélange dans les boîtes de Pétri de 90 mm. Refroidir rapidement et laisser la gélose se solidifier.
- Incuber les plaques à 37 °C pendant 2 jours.
- Répliquer les colonies générées (transformants) en les transférant (à l’aide de cure-dents) dans de nouvelles plaques de gélose BHI contenant les antibiotiques appropriés pour confirmer leurs caractéristiques de résistance. Confirmer le gène de résistance acquise (cfr ou tetM) par PCR de colonie.