Un test liquide multipuits pour le dépistage des renversements de C. elegans

Résumé

Source : Anderson, Q. L. et al. Un système pathologique de C. elegans à haut débit, à haute teneur et à base de liquide. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente une méthode de criblage à haut débit utilisant Caenorhabditis elegans pour étudier les inactivations de gènes lors d’interactions hôte-pathogène. Il décrit la procédure de préparation des vers neutralisés et de leur transfert sur des plaques d’essai afin d’évaluer les effets de l’élimination des vers induite par les agents pathogènes.

Protocole

1. Adaptation pour le criblage de plusieurs souches ou knockdowns de Caenorhabditis elegans (configuration du criblage d’interférence de l’acide ribonucléique (ARNi))

Note: Il s’agit d’un criblage ARNi décrit pour une configuration de plaque à 24 puits.

1. Ajouter 1 mL de S Basal par puits d’une plaque de 24 puits contenant des vers ensemencés avec de l’ARNi. Agitez doucement les vers en secouant la plaque, puis transférez les vers dans une plaque vide et stérile à 24 puits profonds. Laisser les vers se déposer gravitationnellement (~5 minutes).
2. Aspirer le surnageant, en laissant environ 1 mL. Ajouter 7 mL de S Basal dans chaque puits.
3. Répétez les étapes 1.1 - 1.2 au moins 2 fois de plus. Après le lavage final, aspirer le surnageant, en laissant environ 400 μL.
4. À l’aide de la fonction de rééchantillonneur du trieur de vers, triez 22 vers de la suspension de vis sans fin à plaque de 24 puits dans chaque puits d’une plaque de 384 puits (chaque puits d’une plaque de 24 puits donne 8 à 12 puits d’une plaque de 384 puits).
   1. Pour éviter de mourir de faim, pipetez les bactéries dans des plaques à 384 puits (soit une souche qui sert uniquement de nourriture, comme OP50, soit une souche pathogène) avant le tri.
5. Une fois que les vers ont été triés dans la plaque de 384 puits, ajoutez de petites molécules ou d’autres matériaux spécifiques à l’expérience.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		Cytomètre en flux de gros objets/trieur de vers
24 Bloc RB à puits profonds	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Plaque à 384 puits	Greiner Bio-One	MPG-781091
Milieu de croissance des nématodes (NGM)			Quantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de NaCl, 2,5 grammes de peptone, 1 ml de chlorure de calcium (1 M), 1 ml de sulfate de magnésium (1 M), 25 ml de tampon de phospate et 973 ml d’eau milli-Q
S Basal			Quantité par litre : 5,85 grammes de NaCl, 6 grammes de phosphate de potassium monobasique, 1 gramme de phosphate de potassium dibasique et 1 litre d’eau milli-Q
Agar-agar	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
Chlorure de calcium	USBiological Life Sciences
Sulfate de magnésium	Fisher Scientific	M63-500
Tampon phospate			Quantité par litre : 132 mL de phosphate de potassium dibasique (1M) et 868 mL de phosphate de potassium monobasique (1M)
Phosphate de potassium monobasique	Acros Organics	7778-77-0
Phosphate de potassium dibasique	USBiological Life Sciences	P5100
Souches bactériennes
P. aeruginosa (PA14)
Superaliment E. coli (OP50)
Bactérie exprimant l’ARNi d’E. coli (HT115)
Souche de ver
glp-4(bn2) (Beanan et Strome, 1992, PMID : 1289064)