Évaluation de la mortalité induite par des bactéries pathogènes chez les larves de C. elegans

Résumé

Source : Anderson, Q. L., et al. Un système pathologique de C. elegans à haut débit, à haute teneur et à base de liquide. J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo montre un essai en milieu liquide où des larves de C. elegans génétiquement modifiées sont exposées à des bactéries pathogènes dans une microplaque. Les toxines bactériennes sécrétées dans le milieu induisent le stress et la mort de l’hôte. Un colorant fluorescent colore les vers morts, ce qui permet de quantifier la mortalité par imagerie pour évaluer la susceptibilité ou la résistance génétique.

Protocole

1. Configuration du test de destruction des liquides (protocole de base)

Note: Il s’agit d’un protocole pour une souche bactérienne et une source de vers.

1. À l’aide d’un grattoir cellulaire, retirer Pseudomonas aeruginosa d’une plaque de Slow Killing ou SK et la remettre en suspension dans ~ 5 mL de S Basal. Augmentez votre capacité si nécessaire. Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à l’aide d’un spectrophotomètre (OD₆₀₀)
2. Préparer 24 mL de stock dilué de P. aeruginosa dans S Basal à_{une DO de 600} ≈ 0,09 (concentration finale de 3X). Voir 4.6.2 pour le contenu final par puits et le volume de dilution bactérienne en conséquence.
3. Ajouter 21 mL de milieu liquide Slow Kill (3 g de NaCl, 3,5 g de peptone/L complétés par du CaCl₂ et du MgSO₄ jusqu’à une concentration finale de 1 mM). À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 45 μL de bactéries et de milieux dans chaque puits d’une plaque de 384 puits.
4. Laver les vers de leur source dans un tube conique de 50 ml et laisser les vers se déposer sous l’effet de la force gravitationnelle. Aspirer le surnageant à 5 mL. Remettre en suspension dans un total de 50 mL de S basal.
5. Répétez l’étape 1.4 deux fois.
6. À l’aide d’un trieur de vers, triez environ 22 vers dans chaque puits de la plaque de 384 puits.
   Note: La configuration laisse tomber chaque ver dans ~1,1 μL de liquide. 22 vers représenteront 25 μL, ce qui portera le volume total d’analyse à 70 μL/puits.
   1. La composition finale de chaque puits est constituée de 70 μL. 45 μL de ce volume sont ajoutés sous forme de milieu bactérien (0,03 OD,₆₀₀ bactéries dans 24 μL S Basal et 21 μL SK complétés par CaCl₂ et MgSO₄). Les 25 μL restants sont ajoutés avec les 22 vers.
   2. Si le trieur utilisé ici (voir tableau des matériaux) n’est pas disponible, les vers peuvent être dilués à une concentration finale de 1 ver/μL dans S Basal et pipetés à 25 μL/puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Cependant, les résultats peuvent présenter une variabilité accrue. Alternativement, il est possible d’utiliser un distributeur de liquide péristaltique, comme décrit par Leung et ses collègues.
7. Une fois que les vers ont été triés dans la plaque à 384 puits, scellez la plaque avec un film perméable aux gaz et incubez les plaques à 25 °C pendant 24 à 48 h.
8. Au moment souhaité, utilisez un laveur de microplaques pour laver la plaque à 384 puits avec S Basal au total 5 fois.
   1. Après le deuxième lavage, aspirez la majeure partie du média, laissant ~20 μL. Secouez vigoureusement les plaques à l’aide d’un vortex à microplaques pendant au moins 30 secondes pour détacher les débris du fond des puits).
9. Après le lavage final, aspirer le surnageant jusqu’à 20 μL. Ajouter 50 μL de colorant d’acide nucléique 0,98 μM (voir le tableau des matériaux)/puits de la plaque à 384 puits, pour une concentration finale de 0,7 μM.
10. Incuber à température ambiante pendant 12 à 16 h. Ce colorant ne tachera que les vers morts. Après la période d’incubation souhaitée, laver les plaques à l’aide du laveur de microplaques pour enlever toute tache en excès (un minimum de 3 lavages).
11. Pour l’acquisition de données, utilisez un spectrophotomètre ou un microscope automatisé pour imager à la fois la lumière transmise et la fluorescence (excitation de 531 nm et émission de 593 nm).

Matériaux