Évaluation de la mortalité induite par des bactéries pathogènes chez les larves de C. elegans

Résumé

Source : Anderson, Q. L., et al. Un système pathologique de C. elegans à haut débit, à haute teneur et à base de liquide. J. Vis. Exp. (2018)

La vidéo montre un essai en milieu liquide où des larves de C. elegans génétiquement modifiées sont exposées à des bactéries pathogènes dans une microplaque. Les toxines bactériennes sécrétées dans le milieu induisent le stress et la mort de l’hôte. Un colorant fluorescent colore les vers morts, ce qui permet de quantifier la mortalité par imagerie pour évaluer la susceptibilité ou la résistance génétique.

Protocole

1. Configuration du test de destruction des liquides (protocole de base)

Note: Il s’agit d’un protocole pour une souche bactérienne et une source de vers.

1. À l’aide d’un grattoir cellulaire, retirer Pseudomonas aeruginosa d’une plaque de Slow Killing ou SK et la remettre en suspension dans ~ 5 mL de S Basal. Augmentez votre capacité si nécessaire. Mesurer la densité optique de la suspension bactérienne à l’aide d’un spectrophotomètre (OD₆₀₀)
2. Préparer 24 mL de stock dilué de P. aeruginosa dans S Basal à_{une DO de 600} ≈ 0,09 (concentration finale de 3X). Voir 4.6.2 pour le contenu final par puits et le volume de dilution bactérienne en conséquence.
3. Ajouter 21 mL de milieu liquide Slow Kill (3 g de NaCl, 3,5 g de peptone/L complétés par du CaCl₂ et du MgSO₄ jusqu’à une concentration finale de 1 mM). À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 45 μL de bactéries et de milieux dans chaque puits d’une plaque de 384 puits.
4. Laver les vers de leur source dans un tube conique de 50 ml et laisser les vers se déposer sous l’effet de la force gravitationnelle. Aspirer le surnageant à 5 mL. Remettre en suspension dans un total de 50 mL de S basal.
5. Répétez l’étape 1.4 deux fois.
6. À l’aide d’un trieur de vers, triez environ 22 vers dans chaque puits de la plaque de 384 puits.
   Note: La configuration laisse tomber chaque ver dans ~1,1 μL de liquide. 22 vers représenteront 25 μL, ce qui portera le volume total d’analyse à 70 μL/puits.
   1. La composition finale de chaque puits est constituée de 70 μL. 45 μL de ce volume sont ajoutés sous forme de milieu bactérien (0,03 OD,₆₀₀ bactéries dans 24 μL S Basal et 21 μL SK complétés par CaCl₂ et MgSO₄). Les 25 μL restants sont ajoutés avec les 22 vers.
   2. Si le trieur utilisé ici (voir tableau des matériaux) n’est pas disponible, les vers peuvent être dilués à une concentration finale de 1 ver/μL dans S Basal et pipetés à 25 μL/puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Cependant, les résultats peuvent présenter une variabilité accrue. Alternativement, il est possible d’utiliser un distributeur de liquide péristaltique, comme décrit par Leung et ses collègues.
7. Une fois que les vers ont été triés dans la plaque à 384 puits, scellez la plaque avec un film perméable aux gaz et incubez les plaques à 25 °C pendant 24 à 48 h.
8. Au moment souhaité, utilisez un laveur de microplaques pour laver la plaque à 384 puits avec S Basal au total 5 fois.
   1. Après le deuxième lavage, aspirez la majeure partie du média, laissant ~20 μL. Secouez vigoureusement les plaques à l’aide d’un vortex à microplaques pendant au moins 30 secondes pour détacher les débris du fond des puits).
9. Après le lavage final, aspirer le surnageant jusqu’à 20 μL. Ajouter 50 μL de colorant d’acide nucléique 0,98 μM (voir le tableau des matériaux)/puits de la plaque à 384 puits, pour une concentration finale de 0,7 μM.
10. Incuber à température ambiante pendant 12 à 16 h. Ce colorant ne tachera que les vers morts. Après la période d’incubation souhaitée, laver les plaques à l’aide du laveur de microplaques pour enlever toute tache en excès (un minimum de 3 lavages).
11. Pour l’acquisition de données, utilisez un spectrophotomètre ou un microscope automatisé pour imager à la fois la lumière transmise et la fluorescence (excitation de 531 nm et émission de 593 nm).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		Cytomètre en flux de gros objets/trieur de vers
Cytation 5	BioTek
EL406 Distributeur de laveuse	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Bloc RB à puits profonds	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Plaque à 384 puits	Greiner Bio-One	MPG-781091
Milieu de croissance des nématodes (NGM)			Quantité par litre : 18 grammes d’agar-agar, 3 grammes de NaCl, 2,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampon de phospate et 973 mL d’eau milli-Q
Plaques Slow Killing (SK)			Quantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de NaCl, 3,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampon de phospate et 973 mL d’eau milli-Q
Médias Slow Killing (SK)			Quantité par litre : 3 grammes de NaCl, 3,5 grammes de peptone, 1 mL de CaCl₂ (1 M), 1 mL de MgSO₄ (1 M), 25 mL de tampon phosphate et 973 mL d’eau milli-Q
Bouillon de lysogénie (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
Bouillon d’infusion de cœur Brian (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
Solution d’eau de Javel			Quantité par 100 mL : 10 mL de solution de NaOH 5 M, 20 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 5 % et 70 mL d’eau stérile
S Basal			Quantité par litre : 5,85 grammes de NaCl, 6 grammes de KH₂PO₄, 1 gramme de K₂HPO₄ et 1 litre d’eau milli-Q
Agar-agar	USBiological Life Sciences	A0930
NaCl	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
CaCl₂	USBiological Life Sciences
MgSO₄	Fisher Scientific	M63-500
Tampon phospate			quantité par litre : 132 mL de K₂HPO₄ (1M) et 868 mL de KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄	Acros Organics	7778-77-0
K₂HPO₄	USBiological Life Sciences	P5100
Solution d’hypochlorite de sodium à 5 %	BICCA	7495.5-32
Solution NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Respirez facilement	Biotech diversifiée	BEM-1
SYTOX Coloration d’acide nucléique orange	Fisher Scientific	S11368
Souches bactériennes
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Superaliment E. coli (OP50)
E. coli Bactéries exprimant l’ARNi (HT115)
Souches de vers de terre
glp-4(bn2) (Beanan et Strome, 1992, PMID : 1289064)
PINK-1 ::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID : 29532717)