Culture et entretien de bactéries exprimant l’ARNi

Résumé

Source : Anderson, Q. L., et al., Un pathosystème de C. elegans à haut débit, à haut contenu et à base de liquide. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la préparation de bactéries d’interférence ARN (ARNi) portant des plasmides pour inhiber l’expression des gènes cibles. Il décrit les étapes de sélection, de croissance et d’induction des bactéries ARNi pour produire des plaques exprimant l’ARNdb pour les tests en aval.

Protocole

1. Préparation des bactéries d’interférence ARN (ARNi)

1. Étalez ou transférez les souches souhaitées de bactéries contenant de l’ARNi sur des plaques de gélose à bouillon de lysogénie contenant des antibiotiques appropriés (carbénicilline à 100 μg/mL et tétracycline à 15 μg/mL pour les banques Ahringer et Vidal) à partir d’un stock congelé.
   Note: Lorsque vous travaillez avec des bactéries non pathogènes, utilisez soit une enceinte de sécurité biologique de niveau de biosécurité (BSL)-2 A/B, soit une hotte à flux laminaire BSL-1 pour assurer la stérilité des cultures et minimiser les risques de contamination croisée de la bibliothèque.
2. Incuber les plaques pendant 24 h à 37 °C.
3. Conservez les plaques à 4 °C jusqu’à deux semaines.
   1. Au bout de deux semaines, jetez les assiettes et remplacez-les par des assiettes fraîchement préparées.
4. Testez plusieurs souches d’ARNi en parallèle en inoculant individuellement une seule colonie de chaque clone dans 4 mL de LB supplémentée en carbénicilline dans un seul puits d’une plaque à 24 puits profonds ou dans un tube à essai stérile.  
   Note: Il a été rapporté que la tétracycline réduisait l’efficacité de l’ARNi. Ne l’utilisez pas dans ce support.
5. Placez les plaques à puits profonds à 24 puits dans un incubateur à agitation optimisé pour les plaques à plusieurs puits et incubez à 37 °C pendant 16 h tout en agitant à 950 tr/min. Note: Il est difficile d’obtenir une croissance bactérienne uniforme dans des plaques multipuits à l’aide d’un incubateur à agitation classique. L’incubateur à secouer doit être capable de secouer à un minimum de 750 tr/min pour que les cultures se développent correctement. En l’absence d’un agitateur spécialisé, il est possible de cultiver chaque culture dans un tube individuel. Les cultures peuvent être transférées dans la plaque à 24 puits pour être centrifugées par la suite.
6. Recueillir les bactéries par centrifugation pendant 5 minutes à 2 000 x g.
7. Décantez le surnageant en renversant la plaque et en secouant vigoureusement. Remettre en suspension les bactéries ARNi dans 100 μL de S Basal (5,85 g de chlorure de sodium, NaCl ; 1 g de phosphate dipotassique, K₂HPO₄ ; 6 g de phosphate monopotassique, KH₂PO₄ dissous dans 1 L d’eau ultrapure et stérilisé par autoclave).
8. Pipette a remis les bactéries en suspension dans un nombre approprié de puits d’une plaque NGM multipuits (milieu de croissance des nématodes, 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone, 1 mM de chlorure de calcium, CaCl₂ ; 1 mM de sulfate de magnésium, MgSO₄ ; 25 mL de tampon phosphate (quantité par litre : 132 mL de K₂HPO₄ (1 M) et 868 mL de KH₂PO₄ (1M)), et 18 g de gélose par litre d’eau) complété par de l’IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ; concentration finale de 1 mM) et de la carbénicilline (concentration finale de 100 μg/mL).
   1. Utilisez 3,5 mL de média NGM par puits d’une plaque de 6 puits, 1 mL par puits d’une plaque de 24 puits ou 150 μL par puits d’une plaque de 96 puits.
   2. Utilisez 100 μL/puits de bactéries pour une plaque à 6 puits, 50 μL/puits pour une plaque à 24 puits ou 20 μL/puits pour une plaque à 96 puits. Laisser sécher.
      Note: Le séchage est normalement effectué dans une hotte à écoulement stérile pour favoriser un séchage rapide et uniforme. Un séchage uniforme est très important. Évitez de trop sécher, car les fissures dans la gélose favorisent l’enfouissement des vers. Cela entraîne des pertes de vers et un encrassement potentiel des systèmes de manipulation des liquides.
9. Utilisez les plaques préparées immédiatement ou conservez-les à 4 °C jusqu’à deux semaines pour une utilisation ultérieure.
   Note: Pour éviter que les plaques ne se dessèchent, elles peuvent être scellées avec un film de paraffine plastique ou placées dans un récipient hermétiquement fermé avec des serviettes en papier humides.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
24 blocs RB à puits profonds	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Milieu de croissance des nématodes (NGM)			Quantité par litre : 18 grammes d’agar, 3 grammes de chlorure de sodium, 2,5 grammes de peptone, 1 ml de chlorure de calcium (1 M), 1 ml de sulfate de magnésium (1 M), 25 ml de tampon phospate et 973 ml d’eau milli-Q
Bouillon de lysogénie (LB)	USBiological Life Sciences	L1520
S Basal			Quantité par litre : 5,85 grammes de chlorure de sodium, 6 grammes de phosphate monopotassique, 1 gramme de phosphate dipotassique et 1 litre d’eau milli-Q
Agar-agar	USBiological Life Sciences	A0930
Chlorure de sodium	USBiological Life Sciences	S5000
Peptone	USBiological Life Sciences	P3300
Chlorure de calcium	USBiological Life Sciences
Sulfate de magnésium	Fisher Scientific	M63-500
Tampon phospate			Quantité par litre : 132 mL de phosphate dipotassique (1 M) et 868 mL de phosphate monopotassique (1 M)
Phosphate monopotassique	Acros Organics	7778-77-0
Phosphate dipotassique	USBiological Life Sciences	P5100