Expression de l’opéron de luminescence chez les bactéries bioluminescentes marines

Résumé

Source : Brodl, E., et al. In situ Mesure et corrélation de la densité cellulaire et de l’émission de lumière des bactéries bioluminescentes. J. Vis. Exp. 1 (2018)

Cette vidéo montre la culture de bactéries bioluminescentes marines pour observer l’activation de l’opéron de luminescence médiée par la détection du quorum, ce qui permet de surveiller en temps réel l’expression des gènes et l’émission de lumière pour les études de communication microbienne et de régulation des gènes.

Protocole

1. Expression de souches bioluminescentes bactériennes

NOTE: Les souches bioluminescentes bactériennes nécessitent un milieu de croissance spécifique/un milieu d’eau de mer artificiel pour la croissance et la production de lumière.

1. Préparez un milieu artificiel d’eau de mer, composé de deux composants de milieu préparés séparément.
   NOTE: Les quantités suivantes correspondent à 1 L de milieu liquide ou à 1 L de milieu gélosée.
   1. Pour le milieu artificiel d’eau de mer, peser les sels suivants : 28,13 g de NaCl (chlorure de sodium), 0,77 g de KCl (chlorure de potassium), 1,60 g de CaCl₂ · 2H₂O (chlorure de calcium dihydraté), 4,80 g de MgCl₂ · 6H₂O (chlorure de magnésium hexahydraté), 0,11 g de NaHCO₃ (bicarbonate de sodium) et 3,50 g de MgSO₄ · 7H₂O (sulfate de magnésium heptahydraté).
   2. Ajouter 1 L d’eau distillée et dissoudre tous les composants.
   3. Pour le milieu LB (Luria-Bertani), pesez les ingrédients suivants : 10 g d’extrait de levure, 10 g de peptone et pour les plaques de gélose, 20 g d’agar supplémentaire.
   4. Ajouter 250 ml d’eau du robinet et dissoudre les composants.
   5. Autoclave les deux milieux préparés séparément à 121 °C pendant 20 min.
   6. Pour les plaques de gélose, combinez 250 ml de milieu LB avec 750 ml de milieu d’eau de mer artificielle directement après l’autoclave et préparez les plaques.
   7. Pour un milieu liquide, combinez 250 ml de milieu LB avec 750 ml de milieu d’eau de mer artificielle, soit directement après l’autoclavage, soit une fois refroidi.
      NOTE: Le milieu artificiel de l’eau de mer peut devenir trouble par les précipitations de sel.
2. Striez les souches bioluminescentes bactériennes sur des plaques de gélose artificielle à l’eau de mer et incubez pendant la nuit à 24 - 30 °C.
   NOTE: Le stockage à long terme des souches bactériennes est normalement réalisé par la congélation des stocks de glycérol de la culture bactérienne. Les souches doivent toujours être striées sur des plaques de gélose en premier pour assurer des conditions de départ uniformes pour toutes les souches, avant de les utiliser pour des cultures liquides, en raison d’une phase de latence de croissance après la décongélation.
3. Préparez une culture de nuit (ONC) en inoculant 100 mL de milieu d’eau de mer artificielle avec une seule colonie de la plaque. Incuber l’ONC à 24 - 30 °C et 120 tr/min dans un agitateur d’incubation pendant la nuit.
4. Inculquer 800 mL de milieu d’eau de mer artificielle avec 8 mL d’ONC.
5. Incuber les cellules bactériennes à 24 - 30 °C et 120 tr/min dans un agitateur d’incubateur.
   NOTE: Le profil d’intensité lumineuse des bactéries bioluminescentes varie fortement avec la température. Selon les mécanismes de régulation de la production de lumière de la souche bactérienne respective, l’émission de lumière peut commencer après environ 1 à 6 h.
6. Observez la culture cellulaire bactérienne jusqu’à ce qu’elle commence à briller (environ 1 à 6 h).
   NOTE: Selon le but de l’expression, les cellules sont cultivées jusqu’au lendemain et sont ensuite récoltées, ou les cellules peuvent être maintenues en mouvement tant qu’elles brillent. La récolte des cellules et la purification de toutes les protéines peuvent être effectuées selon des procédures standard.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agitateur d’incubateur standard Multitron	Infors AG