Analyse microscopique de la croissance bactérienne sous stress à l’aide de chambres microfluidiques

Résumé

Source : Cayron, J., et al. Analyse multi-échelle de la croissance bactérienne sous traitement de stress. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre comment préparer et utiliser une plaque microfluidique pour l’imagerie des cellules bactériennes dans des conditions de stress. Il décrit le processus d’introduction d’une culture bactérienne et d’un milieu antibiotique induisant un stress, suivi d’une charge cellulaire et d’une configuration microscopique. L’imagerie time-lapse en mode contraste de phase est ensuite utilisée pour observer le développement de cellules filamenteuses allongées avec une teneur accrue en ADN en raison de l’inhibition de la division cellulaire.

Protocole

1. Imagerie microfluidique par microscopie time-lapse
   1. Retirez la solution de conservation de la plaque microfluidique et remplacez-la par un fluide frais préchauffé à 37 °C, comme décrit dans le guide d’utilisation du logiciel microfluidique.
   2. Scellez la plaque microfluidique sur le système de collecteur et cliquez sur le bouton Amorçage.
   3. Placez la plaque microfluidique avec le système de collecteur sur la platine du microscope et préchauffez à 37 °C pendant ~2 h avant de commencer l’acquisition de la microscopie.
      NOTE: Cette étape de préchauffage est essentielle pour éviter la dilatation de la chambre microfluidique, qui modifierait la mise au point du microscope pendant l’expérience en accéléré et compromettrait l’acquisition de l’image.
   4. Scellez la plaque microfluidique. Remplacer le milieu du puits 8 par 150 μL d’échantillon de culture et remplacer le milieu du puits 1 à 5 par le milieu souhaité avec ou sans le réactif induisant le stress.
   5. Scellez la plaque microfluidique et placez-la sur la platine du microscope.
   6. Sur le logiciel microfluidique, exécutez la procédure de chargement des cellules. Vérifiez que la charge des cellules est satisfaisante en regardant au microscope en lumière transmise. Exécutez la procédure de chargement de cellule une deuxième fois si la densité de cellules dans la chambre est insuffisante.
   7. Faites une mise au point minutieuse en mode lumière transmise et sélectionnez plusieurs champs de vision qui montrent des bactéries isolées. Il est important de choisir des champs qui ne sont pas surpeuplés pour pouvoir suivre la croissance des cellules isolées au fil du temps (~10 à 20 cellules par 100 μm² est recommandé). Cela facilitera également la détection des cellules lors de l’analyse des images.
   8. Sur le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Créer un protocole. Programmez l’injection de milieu de croissance pour 1 à 2 équivalents de temps de génération pour permettre aux cellules de s’adapter (facultatif). Programmez ensuite l’injection du milieu induisant le stress pendant 10 min à 2 psi, suivie d’une injection à 1 psi pour la durée souhaitée du traitement du stress. Si vous avez l’intention d’analyser la récupération des cellules après un stress, programmez l’injection de milieu de croissance frais pour la durée souhaitée.
      NOTE: Dans l’expérience présentée ici, la céphalexine a été injectée pendant 10 minutes à 2 psi, suivie de 50 minutes à 1 psi. Ensuite, un milieu de croissance frais a été injecté à 2 psi pendant 10 min, suivi de 3 h à 1 psi.
   9. Effectuez une imagerie microscopique en mode time-lapse avec 1 image toutes les 10 min en utilisant le contraste de phase en lumière transmise et une source lumineuse d’excitation de 560 nm pour le signal mCherry si nécessaire.
      NOTE: Il est important de commencer l’acquisition d’images microscopiques en même temps que le protocole d’injection microfluidique.

Matériaux