Évaluation de l’essaimage bactérien à l’aide d’une plaque inhibitrice de gradient

Résumé

Source : Guo, S., et al. Quantification de la motilité d’essaimage de surface bactérienne sur des plaques de gradient d’inducteur. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo montre l’utilisation d’une plaque d’essaim à gradient à double couche pour étudier le comportement de l’essaimage bactérien sous différentes concentrations d’inhibiteurs. Une plaque avec un inhibiteur formant un gradient dans la couche inférieure est inoculée avec des bactéries et incubée. Des images sont capturées à intervalles réguliers pour analyser l’effet de la concentration d’inhibiteurs sur l’essaimage bactérien.

Protocole

1. Préparation des plaques d’essaims à gradient

1. Préparation du milieu d’essaim
   REMARQUE : Une concentration de 0,7 % (p/v) de gélose dans le milieu de l’essaim a été utilisée dans ce protocole.
   1. Préparez la poudre de bouillon de lysogénie (LB) avec de l’agar dans deux flacons coniques ; chaque fiole contient 2 g de tryptone, 2 g de chlorure de sodium (NaCl), 1 g d’extrait de levure et 1,4 g d’agar. Ajouter de l’eau bi-distillée (ddH₂O) et agiter la suspension à l’aide d’un barreau magnétique. Ajustez le volume final à 200 mL en ajoutant du ddH₂O supplémentaire.
   2. Autoclave la solution à 121 °C pendant 20 min. Utilisez un bouchon perméable à l’air ou un film d’étanchéité de bouteille avec une bouche d’aération.
      REMARQUE : L’agar se dissout lorsqu’il est chauffé dans l’autoclave.
   3. Lorsque la température descend à 65 °C, mélangez la solution pour assurer l’homogénéité et transférez le milieu dans un incubateur à 65 °C ou un bain-marie pour une utilisation à court terme.
2. Préparation du milieu d’essaim de la couche inférieure
   REMARQUE : Le milieu de la couche inférieure est le mélange de milieu d’essaim et de solutions mères inductrices. La formulation des plaques d’essaim à gradient inducteur est présentée dans le tableau 1.
   1. Préparez une solution mère de 100 mM de resvératrol en dissolvant 114,12 mg de poudre de resvératrol lyophilisée dans 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), et conservez la solution à -20 °C.
   2. Préparer une solution mère d’arabinose à 20 % (p/v) en dissolvant 6 g de poudre d’arabinose dans 30 mL de ddH₂O ; attendre 10 à 15 minutes pour permettre à l’arabinose de se dissoudre ; et conservez la solution à température ambiante.
   3. Sortez le milieu de l’incubateur à 65 °C et placez-le à température ambiante ; laisser refroidir le milieu de l’essaim jusqu’à ce que l’erlenmeyer soit suffisamment froid pour tenir (~50 °C). Ne placez pas le milieu d’essaim à température ambiante pendant de longues périodes, car cela provoquerait la solidification de l’agar.
   4. Ajouter le volume requis de la solution mère inductrice dans le milieu d’essaim à 50 °C (Tableau 1). Utilisez une pipette pour distribuer la solution d’inducteur au lieu de la verser. Agitez doucement pour mélanger l’inducteur avec le milieu d’essaim.
      REMARQUE : Cette étape concerne les inducteurs qui ne peuvent pas être autoclavés. Attention à ne pas introduire de bulles dans le milieu.
3. Préparation de plaques d’essaim à gradient double couche
   REMARQUE : Le milieu de la couche supérieure est un milieu LB contenant 0,7 % (p/v) d’agar.
   1. Étiquetez les boîtes de Pétri carrées de 13 x 13 cm avec le nom de l’inducteur et les souches, et calez les boîtes sur le bord des couvercles (figure 1B).
   2. Ajouter 40 ml de milieu de couche inférieure chaud (50 °C) à l’aide d’une pipette de 50 ml ou d’un tube à centrifuger de 50 ml.
      REMARQUE : Alternativement, pour des boîtes de Pétri carrées de 13 x 13 cm, une couche inférieure de 40 ml et un milieu de couche supérieure conviennent ; pour les boîtes de Pétri carrées de 10 x 10 cm, une couche inférieure de 25 ml et un support de couche supérieure conviennent.
   3. Laissez le milieu de la couche inférieure durcir à découvert pendant 1 h à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Ne dérangez pas les boîtes de Pétri carrées pendant que le milieu se solidifie.
      REMARQUE : Pendant le durcissement de la couche inférieure, le milieu d’essaim ne contenant pas d’inducteurs doit être maintenu dans un incubateur à 65 °C ou un bain-marie.
   4. Une fois que la couche inférieure est complètement solidifiée, retirez les couvercles et placez les boîtes de Pétri carrées à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
   5. Ajouter 40 ml de milieu de couche supérieure chaud (50 °C) à l’aide d’une pipette de 50 ml ou d’un tube à centrifuger de 50 ml.
      REMARQUE : Le milieu de la couche supérieure ne contient pas d’inducteurs.
   6. Durcissez les plaques à double couche sur la paillasse, couvertes et non dérangées pendant 1 h. Conservez les plaques préparées à 4 °C jusqu’à 24 h.REMARQUE : Des temps de durcissement plus longs réduiraient la teneur en humidité et limiteraient la motilité de l’essaimage.

2. Croissance d’E. coli K12 et de P. aeruginosa PAO1

1. Préparez 500 ml de milieu LB en ajoutant 5 g de tryptone, 5 g de NaCl et 2,5 g d’extrait de levure dans du ddH₂O, et complétez la solution à 500 ml. Autoclavez la solution sur le cycle liquide pendant 20 min à 121 °C et conservez-la à 4 °C.
2. Préparez 100 ml de milieu gélosé LB à 1,5 % (p/v) en ajoutant 1 g de tryptone, 1 g de NaCl, 0,5 g d’extrait de levure et 1,5 g de gélose dans du ddH₂O et complétez la solution à 100 ml. Autoclavez la solution sur cycle liquide pendant 20 min à 121 °C. Transférez le milieu dans un bain-marie à 50 °C pour éviter que la gélose ne se solidifie.
3. Lorsque la fiole de milieu de gélose LB est confortable à tenir, ajouter 20 ml de milieu de gélose LB dans une boîte de Pétri (10 cm de diamètre) à l’aide d’une pipette de 25 ml. Laissez la plaque à température ambiante pendant la nuit et conservez la plaque de gélose LB à 4 °C.
4. Prélever des cultures mères entreposées à -80 °C, strier les souches E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PAO1-YdeH sur des boîtes de Pétri LB-agar à l’aide de boucles d’inoculation jetables. Incuber les boîtes de Pétri inversées pendant la nuit à 37 °C.
5. Prélever des colonies individuelles pour différentes souches dans les boîtes de Pétri, inoculer chaque colonie dans 5 mL de milieu LB et incuber la culture à 37 °C dans un agitateur orbital de laboratoire réglé à 220 tr/min.
6. Lorsque la densité de culture atteint OD600nm ~1.0, retirez la culture de l’agitateur et placez-la à température ambiante. Ajustez la densité de culture à OD600nm = 1,0, comme décrit à l’étape 3.2.1.

3. Inoculation et incubation de plaques d’essaim à gradient

1. Préparation des puits d’inoculation
   REMARQUE : L’impression 3D de modèles de couverture capables de générer des puits séparés par une distance standard peut être utilisée à la place de la méthode décrite ci-dessous.
   1. Marquez les positions des puits sur du papier A4, comme illustré à la figure 1C. Réglez trois concentrations d’essai dans une boîte de Pétri carrée avec deux ou trois répétitions.
   2. Placez le papier A4 marqué sous une plaque dégradée solidifiée. Enfoncez le côté le plus large d’une pointe de pipette de 100 μL dans la surface du support semi-solide à l’endroit indiqué. Appuyez sur la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’elle atteigne le bas de la couche supérieure de fluide.
   3. Lorsque la pointe touche le fond, n’appliquez aucune force verticale sur la pointe ; Tournez doucement la pointe pour isoler le contenu du puits cylindrique.
   4. Déplacez horizontalement les pointes de pipette sur une très petite distance pour permettre à l’air de circuler dans l’espace étroit réservé à cet effet. Appuyez sur l’embout avec l’index pour bloquer l’écoulement de gaz à l’intérieur de l’embout tout en tenant la pipette à l’aide du pouce et du majeur.
   5. Tirez l’embout verticalement, en gardant le bien contenu dans l’embout tout en le retirant.
      REMARQUE : Si le contenu du puits glisse, appliquez un peu plus de pression avec l’index pour sceller complètement l’embout.
   6. Répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.5 dans chaque position marquée. Couvrez la plaque d’essaim avant l’inoculation.
2. Inoculation et incubation sur plaque à gradient
   1. Ajustez la densité de culture de croissance nocturne à OD600nm = 1,0.
   2. Pipeter 80 μL de la culture de croissance de nuit dans chaque puits. Ne renversez pas la culture bactérienne à l’extérieur des puits.
   3. Enveloppez les plaques d’un film d’étanchéité. Pour une observation à long terme (3 à 5 jours), enveloppez les plaques avec du ruban adhésif en caoutchouc de laboratoire stérile.
      REMARQUE : Le ruban en caoutchouc est moins susceptible de se casser.
   4. Placez un bécher rempli de ddH₂O dans l’incubateur pour maintenir l’humidité à l’intérieur de l’incubateur. Incuber les plaques d’essaim dégradées à 37 °C.
      REMARQUE : Ne pas incuber les plaques d’essaim à l’envers ; Cela provoquera une fuite de la culture bactérienne des puits.
   5. Imagez la plaque d’essaim immédiatement après l’inoculation, en l’enregistrant comme le point de temps 0 h.

4. Imagerie de l’essaimage de la surface bactérienne

1. Sortez les plaques de l’incubateur, une à la fois, toutes les 12 h, en tenant la plaque horizontalement, et placez-les dans le système d’imagerie sur gel (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Ne laissez pas d’empreintes digitales sur la surface des plaques ; Tenez le côté de la plaque d’essaim avec des gants propres.
2. Sélectionnez le mode d’imagerie sur gel  ; exposer la plaque d’essaim à la lumière blanche ; et ajustez la distance focale pour donner la vue la plus claire des essaims.
   REMARQUE : Utilisez la même distance focale pour toutes les plaques d’un lot donné.
3. Améliorez la luminosité des essaims pour une observation claire en ajustant le temps d’exposition à 300 ms. Ajustez le seuil pour minimiser les interférences de la lumière de fond.
   REMARQUE : Le seuil est ajusté sur l’interface de fonctionnement du système d’imagerie en gel. Augmentez les valeurs sur la gauche pour minimiser les interférences de la lumière de fond ; Diminuez les valeurs sur la droite pour améliorer la luminosité des essaims. Dans ce protocole, la région se situe généralement entre 6 000 et 50 000 habitants.
4. Enregistrez le fichier image pour une analyse plus approfondie. Enregistrez le temps d’imagerie, le type d’inducteur, l’orientation du gradient et les déformations dans un fichier .txt .

 

Tableau 1 : Spécifications du milieu d’essaim à double couche.

Couche supérieure moyenne/bouillon de lysogénie moyen (par 100 ml)
Tryptone : 1 g
Chlorure de sodium : 1 g
Extrait de levure : 0,5 g
Gélose : 0,7 g
Milieu de la couche inférieure/milieu contenant de l’inducteur (par 100 ml)
Tryptone : 1 g	Concentration de travail :	Concentration de la solution mère :
Chlorure de sodium : 1 g
Extrait de levure : 0,5 g	- Resvératrol : 400 μM	- Resvératrol : 100 mM
Gélose : 0,7 g
Inducteur:	- Arabinose : 0,5 % (p/v)	- Arabinose : 20 % (p/v)
- Solution mère de resvératrol : 400 μL	ou 1 % (p/v)
- Solution mère d’arabinose : 2,5 mL ou 5 mL

Résultats

Figure 1 : Schéma de la préparation, de l’inoculation et de l’incubation de la plaque d’essaim à gradient d’inducteur. (A) Croissance nocturne d’une culture bactérienne à 37 °C. (B) Flux de travail d’une plaque d’essaim à gradient d’inducteu...

Matériaux