Détection colorimétrique de la dégradation du cortex lors de la germination de spores bactériennes

Résumé

Source : Francis, M. B., et al. Détection de fragments de cortex pendant la germination de spores bactériennes. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo présente une méthode colorimétrique permettant de détecter la dégradation du cortex pendant la germination des spores bactériennes en mesurant la libération de sucres réducteurs au fil du temps. À l’aide d’étalons de N-acétylglucosamine et d’échantillons ponctuels, le test quantifie la concentration en sucre par une réaction chromogène violette, indiquant l’étendue de l’hydrolyse du cortex.

Protocole

1. Réactif de couleur

1. Pendant que les échantillons sont sur de la glace, préparez le réactif de couleur. Dissoudre 0,320 g de p-diméthylaminobenzaldéhyde (DMAB ; réactif d’Ehrlich) dans 1,9 ml d’acide acétique glacial.
   Note: Le réactif est sensible au temps, à la température et à la lumière et ne doit pas être préparé à l’avance.
2. Une fois que le DMAB s’est complètement dissous, ajoutez 100 μl de HCl 10 N et vortex.
3. Ajouter 5 ml d’acide acétique glacial et vortex.

2. Réaction colorimétrique

1. Transférez 100 μl de chaque échantillon de cortex refroidi dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Ajoutez 700 μl de la solution colorante fraîchement préparée à chaque échantillon.
3. Transférez immédiatement les échantillons dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant EXACTEMENT 20 min.
4. Transférez 200 μl de chaque échantillon dans une plaque transparente à 96 puits.
5. Quantifier les échantillons à 585 nm sur un lecteur de plaques. Les échantillons doivent commencer à une couleur jaune et une réaction positive passera au violet. Plus il y a de cortex, plus la couleur violette est profonde.

Matériaux