Production et récupération de protéines recombinantes à partir de vésicules dérivées de bactéries

Résumé

Source : Streather, B. R., et al. Production et analyse optimisées de vésicules remplies de protéines recombinantes d’E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo démontre la production et l’isolement de protéines recombinantes marquées avec le peptide de nucléation des vésicules (VNp) à partir de vésicules bactériennes. Un inducteur déclenche l’expression de la protéine marquée VNp, entraînant la formation et l’encapsulation des vésicules, suivie d’une centrifugation et d’une sonication pour une récupération efficace des protéines sans lyse cellulaire

Protocole

1. Culture cellulaire bactérienne et induction de protéines

1. Pour induire l’expression de la protéine recombinante à partir du promoteur T7, ajouter de l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale allant jusqu’à 20 μg/mL (84 μM). L’induction de l’expression de la protéine recombinante doit se produire à la phase logarithmique tardive (c’est-à-dire une densité optique typique, DO₆₀₀ de 0,8-1,0) pour la production de vésicules. ​
   NOTE: La durée de la période d’induction peut différer d’une protéine à l’autre, certaines atteignant leur production maximale à 4 h et d’autres pendant la nuit (18 h). À ce jour, l’exportation maximale de vésicules a été obtenue dans des cultures nocturnes.

2. Isolement des vésicules recombinantes

1. Granulez les cellules par centrifugation à 3 000 x g (4 °C) pendant 20 min.
2. Pour stériliser un milieu contenant des vésicules en vue d’un stockage à long terme, faites passer le milieu de culture nettoyé à travers un filtre en polyéthersulfone (PES) stérile et sans détergent de 0,45 μm.
   NOTE: Pour tester l’exclusion des cellules viables du filtrat contenant des vésicules, déposer sur une gélose à base de bouillon de lysogénie (LB) et incuber toute la nuit à 37 °C.
3. Pour concentrer les vésicules dans un volume plus petit, faites passer le milieu stérile contenant des vésicules à travers un filtre à esters de cellulose mixtes (MCE) stérile et sans détergent de 0,1 μm.
4. Lavez délicatement la membrane avec 0,5 à 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile à l’aide d’un grattoir cellulaire ou d’un épandeur en plastique pour retirer soigneusement les vésicules de la membrane. Transférer dans un tube de microfuge frais. ​
   NOTE: Les vésicules purifiées peuvent être stockées dans un milieu stérile ou du PBS à 4 °C. Il existe des exemples de protéines recombinantes stockées dans ces vésicules pendant 6 mois, de cette manière, sans perte d’activité enzymatique.

3. Libération de protéines solubles à partir de vésicules isolées

1. Une fois que les vésicules contenant des protéines ont été isolées dans le milieu stérile ou le tampon, soumettre les membranes lipidiques vésiculaires à la sonication en utilisant un calendrier approprié pour l’appareil (p. ex., cycles de marche et d’arrêt de 6 x 20 s) et centrifuger à 39 000 x g (4 °C) pendant 20 minutes pour éliminer les débris de la vésicule. NOTE: Un traitement par choc osmotique ou détergent peut être utilisé comme alternative pour ouvrir les vésicules, mais il faut tenir compte de l’impact sur la fonctionnalité des protéines et/ou l’application en aval.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Melford	367-93-1
Bouillon de lysogénie (LB) / gélose LB	Stock de laboratoire	NA	10 g/L de tryptone ; 10 g/L de NaCl ; 5 g/L d’extrait de levure (1,5 g/L d’agar)
MF-Millipore Filtre à membrane (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Filtre à membrane Millipore Express PLUS (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Stock de laboratoire	NA