F Transfert de plasmide et double sélection d’antibiotiques chez E. coli

Résumé

Source : Erdogan, F., et al., Tests d’accouplement conjugatif pour l’analyse spécifique à la séquence des protéines de transfert impliquées dans la conjugaison bactérienne. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre la procédure de transfert d’un plasmide F de cellules E. coli donneuses à receveuses à l’aide d’un plasmide de secours et de sélection de transconjugants par double résistance aux antibiotiques. Le processus comprend le mélange de cultures bactériennes, l’incubation sans secousse, la perturbation des couples d’accouplement et le placage sur des milieux sélectifs pour confirmer le transfert réussi des plasmides.

Protocole

1. Essai d’accouplement conjugatif de donneurs XK1200 à receveurs de MC4100

1. Préparer une culture O/N de cellules XK1200 pOX38-Tc Δgene ::Cm + pK184-gene dans 20 mL de bouillon de lysogénie stérile (LB) avec 20 μg/mL de chloramphénicol (Cm), 50 μg/mL de kanamycine (Km) et MC4100 dans 5 mL LB avec 50 μg/mL de streptomycine (Sm) en utilisant des cellules d’un stock de glycérol ou d’une colonie unique sur une plaque de gélose et une pipette ou une boucle stérile. Cultivez des cultures à 37 °C en secouant à 200 tr/min.
2. Faire des dilutions de 1:70 de chaque culture O/N séparément dans 2 mL de LB stérile avec les mêmes antibiotiques. Ajouter du glucose à une concentration finale de 100 mM dans toutes les cellules du donneur. Cultiver les cellules jusqu’à la phase mi-logarithmique (OD₆₀₀ 0,5-0,7) à 37 °C avec agitation à 200 tr/min.
3. Centrifuger (4 000 x g pendant 5 min à 4 °C) pour granuler les cellules, jeter le surnageant, laver une fois avec du LB stérile à froid pour éliminer les antibiotiques et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de LB stérile à froid.
4. En double, aliquote 100 μL de chaque culture dans 800 μL de milieu LB stérile et laissez-les s’accoupler à 37 °C pendant 1 h sans agiter.
5. Vortex les cellules pendant 30 s pour perturber les couples d’accouplement et placez-les sur de la glace pendant 10 minutes pour éviter tout nouvel accouplement.
6. À l’aide du mélange vortex et du LB stérile frais, préparer 6 dilutions (^10-2 à ^10-7) des transconjugants. Sélectionner les cellules transconjuguées MC4100 pOX38-Tc Δgene ::Cm en repérant 10 aliquotes μL de chaque dilution sur chaque moitié de plaques de gélose contenant 50 μg/mL Sm et 20 μg/mL Cm, comme indiqué sur la figure 1. Répétez l’opération pour les deux mélanges en double. Gardez la zone stérile et travaillez près d’une flamme. Incuber les plaques O/N à 37 °C.

Résultats

Figure 1 : Essai d’accouplement pour évaluer la fonction du gène cible en conjugaison. Les cellules donneuses et receveuses étaient E . coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF ::Cm transformées avec pK184-TraF et MC4100, re...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pétri	Fisher Scientific	FB0875713
Antibiotiques			Concentrations finales
Chloramphénicol (cm)	Fisher Scientific	Réf. BP904-100	20 μg/mL
Kanamycin (km)	BioBasic Inc.	Réf. DB0286	50 μg/mL
Streptomycine (Sm)	Fisher Scientific	BP910-50	50 μg/mL