Inactivation de bactéries à l’aide d’un mononucléotide de flavine activé par la lumière

Résumé

Source : Cheng, C., et al. Inactivation des agents pathogènes par photolyse en lumière visible de la riboflavine-5'-phosphate. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo présente une méthode d’évaluation des effets phototoxiques du mononucléotide de flavine (FMN) sur les bactéries pathogènes. Les cultures bactériennes sont exposées à des concentrations croissantes de FMN et éclairées par une lumière visible pour générer des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui endommagent les composants cellulaires. Les bactéries survivantes sont ensuite quantifiées afin d’évaluer la réduction dose-dépendante de la viabilité.

Protocole

1. Viabilité de Staphylococcus aureus (S. aureus) après photolyse de la FMN (Figure 1)
   1. Transmettre une colonie de S. aureus (BCRC 10451) à partir d’une plaque cultivée dans 10 mL de bouillon de lysogénie prélevé dans un tube à essai à bouchon vissé de 15 mL. Culture dans un agitateur à 37°C pendant 16 h.
   2. Transférez 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Ajouter de l’eau stérilisée dans le tube à centrifuger pour diluer la culture à une densité optique de 0,5 à 600 nm (DO₆₀₀) (~6 x 10⁷ unités formant colonies [UFC]/mL).
   3. Transférez 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, centrifugez à 14 000 x g pendant 10 min et décantez le surnageant pour obtenir une pastille cellulaire.
   4. Ajouter 1 mL de riboflavine-5'-phosphate (ou mononucléotide de flavine ; FMN) (30, 60 et 120 μM FMN dans un tampon de phosphate de potassium [PB]) dans les pastilles cellulaires obtenues comme à l’étape 1.3, et vortex. Pour un contrôle irradié, ajouter 1 mL de PB seul.
   5. Transvaser 1 mL de solutions cellulaires bactériennes viables contenant 30 μM de FMN et de PB seuls dans des tubes de verre, et les irradier avec une lumière violette à 10 W/m² pendant 30 min.
   6. Transvaser 1 mL de chacune des solutions cellulaires bactériennes viables contenant 30, 60 et 120 μM de FMN et de PB seuls dans des tubes de verre et les irradier avec une lumière bleue à 20 W/m² pendant 120 min. Mettre en place un autre tube de verre avec 1 mL de solution de cellules bactériennes viables contenant 120 μM de FMN et l’irradier avec une lumière bleue à 20 W/m² pendant 60 min.
   7. Installez les tubes à essai comme décrit aux étapes 1.5 et 1.6 et couvrez-les d’une épaisse feuille d’aluminium. Ces tubes servent de commandes sombres.
   8. Conservez la chambre d’irradiation (ainsi que les commandes sombres) dans une pièce froide à 9 ± 1 °C pendant la période d’irradiation de 30 à 120 minutes.
      NOTE: La chaleur dégagée par les diodes électroluminescentes (LED) ne peut être ignorée, car les puces LED placées à l’intérieur de la coupelle peuvent chauffer le système de photoréaction pendant les expériences d’irradiation. Les expériences ont donc été menées dans une chambre froide maintenue à 9 ± 1 °C.
   9. Après l’irradiation, transférez 0,2 mL de chacune des solutions réactionnelles sur une plaque de gélose Luria (LA). Répartissez les bactéries sur la plaque à l’aide d’une tige de verre en forme de L et incubez toute la nuit à 37 °C.
   10. Calculer le nombre de plaques viables et les taux d’inactivation de S. aureus après une croissance nocturne.

NOTE: Le taux d’inactivation de S. aureus est calculé comme le pourcentage de réduction, qui est égal à [1 -I / D] ×100 %, où I et D désignent, respectivement, le nombre d’UFC dans l’échantillon irradié et le témoin sombre. Le pourcentage de réduction est défini comme une valeur négative du taux d’inactivation.

Résultats

Figure 1 : Effet de la photolyse FMN sur la viabilité de S. aureus.Le pourcentage de réduction est défini comme une valeur négative du taux d’inactivation pour S. aureus traité avec (A

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lumières LED bleues, vertes et rouges	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taïwan		CC 12 V 5050
Sulfoxyde de diméthyle	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	190186
Thermomètre infrarouge	Raytek Co. Santa Cruz, Californie	MT4
Bouillon LB	Difco Co., NJ
L-Méthionine	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Alimentation	China tech Co., New Taipei City, Taïwan	YP30-3-2
Riboflavine 5′-phosphate	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Réf. R7774
RNase	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Compteur d’énergie solaire	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taïwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centre de collecte et de recherche sur les bioressources (BCRC), Hsinchu, Taïwan	10451
Spectromètre optique UV-Vis	Ocean Optics, Dunedin, Floride	USB4000
Spectrophotomètre UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Japon	U-2900
LED violette	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Chine