Quantification de l’inactivation bactérienne induite par la lumière par génération d’espèces réactives de l’oxygène

Résumé

Source : Cheng, C., et al. Inactivation des agents pathogènes par photolyse en lumière visible de la riboflavine-5'-phosphate. J. Vis. Exp. (2022).

Dans cette vidéo, un mélange réactionnel tamponné contenant de la L-méthionine, du nitro-bleu tétrazolium (NBT) et du mononucléotide de flavine (FMN) est irradié avec une lumière violette pour induire la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Cela conduit à l’inactivation bactérienne et à la formation de formazan détectable par spectrométrie.

Protocole

1. Détection d’espèces réactives de l’oxygène (O₂•⁻) chez Staphylococcus aureus

1. Préparez les échantillons de Staphylococcus aureus .
2. Diluer la densité bactérienne des échantillons avec de l’eau stérilisée à une densité optique de 0,5 à 600 nm (DO (densité optique) ₆₀₀, ~6 x 10⁶ UFC (unité formant colonie) /mL). Transférez 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant pour obtenir une pastille cellulaire.
3. Ajouter 0,1093 g de L-méthionine, 0,1 g de NBT (chlorure de nitro-bleu tétrazolium) et 25 mL de FMN (mononucléotide de flavine) (400, 240 ou 120 μM) à 75 mL de PB (tampon phosphate). Pour chaque 1 mL de réactif appliqué, les concentrations finales de FMN, de méthionine et de NBT sont respectivement de 100 (60 ou 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M et 1,2 × ^10-3 M.
4. Ajouter 1 mL de chaque solution de réactif (c.-à-d. avec des concentrations variables de FMN) aux pastilles de cellules obtenues. Irradier les solutions par une lumière violette à 10 W/m² pendant 10 min.
5. Centrifuger le mélange à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour extraire le NBT réduit. Détectez les espèces O₂•⁻ produites à partir de l’absorbance à 560 nm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sulfoxyde de diméthyle	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	190186
Thermomètre infrarouge	Raytek Co. Santa Cruz, Californie	MT4
Bouillon LB	Difco Co., NJ
L-Méthionine	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	1.05707
NBT (chlorure de nitro-bleu tétrazolium)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Alimentation	China tech Co., New Taipei City, Taïwan	YP30-3-2
Riboflavine 5′-phosphate	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	Réf. R7774
Compteur d’énergie solaire	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taïwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centre de collecte et de recherche sur les bioressources (BCRC), Hsinchu, Taïwan	10451
Spectromètre optique UV-Vis	Ocean Optics, Dunedin, Floride	USB4000
Spectrophotomètre UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Japon	U-2900
LED violette	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Chine