Détermination de l’efficacité antibactérienne d’une bandelette polymère chargée d’antibiotiques

Résumé

Source : Sekar, A., et. al., Une nouvelle méthode pour déterminer l’activité antibactérienne longitudinale des matériaux d’élution de médicament. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo présente un test basé sur la luminescence pour évaluer l’efficacité antibactérienne d’une bande polymère chargée d’antibiotiques en quantifiant la luminescence induite par l’ATP, qui diminue dans les cultures bactériennes exposées à l’antibiotique.

Protocole

Configuration de l’étude d’activité antibactérienne en fonction du temps

1. Cultivez les bactéries pendant la nuit dans 1 mL de bouillon TSB (bouillon de soja tryptique).
2. Diluer la suspension bactérienne cultivée pendant la nuit à 10⁵ UFC/mL dans du MHB stérile (bouillon Mueller-Hinton) et vérifier le nombre de bactéries viables à l’aide des unités de luminescence avant de commencer l’expérience.
3. Placez les bandelettes vierges en UHMWPE (polyéthylène de poids moléculaire ultra-élevé) et en UHMWPE chargées de médicament (3 mm x 5 mm x 10 mm) dans une seringue de 3 ml.
4. Aspirez la MHB contenant 10⁵ UFC/mL dans la seringue à l’aide de l’aiguille attachée jusqu’à la marque de 1,5 mL, ce qui équivaut à 1,35 mL de MHB (Figure 1 : étape 1).
5. Placez la seringue dans un incubateur à agitation (100 tr/min) à 37 °C jusqu’aux points de temps indiqués : 6 h, Jour 1, Jour 2, Jour 3, Jour 4, Jour 5, Jour 6 et Jour 7 (Figure 1 : Étape 2).
6. À chaque point de temps indiqué, sortez la seringue et effectuez un test de viabilité microbienne en temps réel sur 100 μL de suspension bactérienne (Figure 1 : étapes 3 et 4).
   1. Effectuez le test basé sur la luminescence à l’aide de plaques blanches à fond opaque de 96 puits.
   2. Mélanger 100 μL de suspensions bactériennes diluées avec 100 μL de réactif de dosage.
   3. Placez un couvercle recouvert de papier d’aluminium sur la plaque à 96 puits préparée et incubez pendant 5 minutes à 100 tr/min en secouant.
   4. Mesurez immédiatement la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques en utilisant les paramètres suivants dans le logiciel Gen5 3.11.
      1. Cliquez sur Nouveau pour configurer un protocole dans la fenêtre du Gestionnaire des tâches .
      2. Sélectionnez Costar 96 blanc opaque dans le menu déroulant pour Type de plaque.
      3. Cliquez sur Lire dans le menu Sélectionner les étapes > les actions .
      4. Cliquez sur Luminescence dans la fenêtre Méthode de lecture. Conservez les options de fibre Endpoint/kinetic et Luminescence sélectionnées sous Type de lecture et Type optique, respectivement. Cliquez sur OK.
      5. Conservez les paramètres dans la fenêtre de lecture (gain = 135 ; temps d’intégration = 1 seconde ; hauteur de lecture = 4,5 mm). Cliquez sur OK.
      6. La fenêtre de disposition des plaques semble prête pour l’exécution. Cochez la case Utiliser le couvercle dans la fenêtre de la plaque de charge et cliquez sur OK.
      7. Placez la plaque à 96 puits dans la machine pour lire les valeurs de luminescence.
7. Déterminez le nombre de bactéries viables pour les points de temps de 6 h, jour 1, jour 2, jour 3 et jour 7. Déterminez les UFC/mL à partir des unités de luminescence à l’aide de la courbe standard correspondante.
8. Vérifier l’absence de bactéries viables dans les échantillons qui ont montré des valeurs de luminescence inférieures à la limite de détection en effectuant la méthode de la plaque étalée sur des plaques de gélose de soja tryptique (TSA) et en incubant à 35 °C pendant la nuit. Vérifiez la présence de colonies le lendemain.
9. Centrifuger la suspension bactérienne restante à 10 000 × g pendant 10 min et aspirer doucement le milieu usé. Pour les tubes dans lesquels les pastilles ne sont pas observées visuellement en raison de l’activité antibactérienne des médicaments, laissez 100 μL dans le tube pour s’assurer que la pastille invisible n’est pas perturbée (Figure 1 : Étape 5).
10. Remettez en suspension les bactéries granulées dans du MHB frais et aspirez la suspension bactérienne dans la même configuration de seringue à l’aide de l’aiguille attachée (Figure 1 : étape 6).

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du dispositif expérimental.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ATCC 12600	American Type culture Collection, VA, États-Unis
Essai de viabilité cellulaire microbienne BacTiter-Glo	Promega Corporation, États-Unis	Référence G8231
Bouillon de soja BD Bacto Tryptic (milieu de digestion soja-caséine)	Becton-Dickinson, États-Unis	BD 211825	Acheté chez Fisher Scientific, États-Unis
BD Seringue Luer-Lok stérile, à usage unique, 3 mL	BD, États-Unis	309657
Aiguille BD 5/8 po. à usage unique, stérile, 25 G	BD, États-Unis	305122
Milieu de culture déshydraté BD BBL : Bouillon Mueller Hinton II (ajusté en fonction des cations)	Becton-Dickinson, États-Unis	Réf. B12322	Acheté chez Fisher Scientific, États-Unis
Milieu de culture déshydraté BD Difco : gélose tryptique au soja (gélose digeste de soja-caséine)	Becton-Dickinson, États-Unis	Référence : DF0369-17-6	Acheté chez Fisher Scientific, États-Unis
Sulfate de gentamicine	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, Chine
Incubateur à secousses de paillasse LSE	Corning, NY, États-Unis
Lecteur de plaques (Synergy H1	Biotek, VT, États-Unis
Agitateur Innova 2100	New Brunswick Scientific, NJ, États-Unis
UHMWPE	GUR1020, Celanese, TX, États-Unis
Chlorhydrate de vancomycine	Fagron, Pays-Bas	804148