Structuration microfluidique et suivi par fluorescence de la croissance bactérienne unicellulaire

Résumé

Source : Pioli, R., et al., Structuration des micro-organismes et des microparticules par assemblage séquentiel assisté par capillarité. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre la méthode de capture de cellules uniques d’Escherichia coli (E. coli) marquées par fluorescence dans des pièges microfluidiques à l’aide d’une suspension sans carbone et d’un flux contrôlé, suivi d’un ajout de nutriments pour déclencher la croissance et d’une imagerie par fluorescence des microcolonies.

Protocole

1. Motifs bactériens

1. Un jour avant l’expérience, faire croître une population d’Escherichia coli (souche MG1655 prpsM-GFP). Inoculer la culture directement à partir du stock congelé et faire croître pendant une nuit pendant 20 h dans un milieu de bouillon de lysogénie (LB) dans un incubateur à agitateur à 37 °C. Ajouter 50 μg/mL de kanamycine pour que les cellules conservent le plasmide prpsM-GFP (protéine fluorescente verte).
2. Le jour de l’expérience, réglez l’incubateur à 37 °C (figure 1A) plusieurs heures avant l’expérience pour assurer une température uniforme et stable avant de commencer. Ensuite, installez le pousse-seringue et la plaque de verre chauffée sur la platine du microscope (Figure 1B,C), en réglant la température à la même température que l’incubateur.
   NOTE: L’incubateur dans lequel l’ensemble du système, y compris le microscope (figure 1E), est enfermé, garantit le maintien d’une température uniforme et constante pendant toute la durée de l’expérience lorsque le canal est rincé avec du fluide.
3. Quatre-vingt-dix minutes avant l’expérience, placez la puce microfluidique dans un récipient rempli d’éthanol à 100 % (EtOH) et rincez le canal avec de l’EtOH à 100 % pendant au moins 10 min. Placez la puce microfluidique dans un dessiccateur sous vide et dégazez pendant au moins 30 min. Remplacez l’EtOH par de l’eau distillée et traitez la puce sous vide pendant au moins 30 min. Mettez la puce microfluidique dans le four à 70 °C pendant 10 min pour éliminer toute trace de liquide laissée dans le canal.
   NOTE: Cette étape est nécessaire pour éviter la formation de bulles dans le canal lorsqu’il est rincé avec un milieu de culture.
4. Pipeter 1 mL de milieu d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) (1x) dans un flacon de centrifugeuse et ajouter 10 μL de phosphate de potassium 0,132 M (K₂HPO₄). Prélever la culture de nuit de l’incubateur à 37 °C et aliquote 100 μL dans le flacon de centrifugation et centrifuger la culture à 2 300 × g pendant 2 min. Pipetez doucement le surnageant hors des flacons de centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 1 mL de milieu MOPS frais avec 0,015 % v/v de Tween 20 et 0,01 % v/v de phosphate de potassium.
   NOTE: La concentration typique de la suspension bactérienne est de l’ordre de 0,015 à 0,15 % vol, ce qui garantit la formation d’une zone d’accumulation étendue et mobile et empêche l’accumulation de particules sur le substrat. Le remplacement du milieu de nuit par un milieu frais minimise le risque de libération de pellicules de bactéries sur le modèle. L’absence de source de carbone dans le milieu frais empêche les cellules de se développer en suspension pendant la structuration du modèle. Une concentration de 0,015 % v/v de Tween 20 dans la suspension est nécessaire pour que l’angle de contact du liquide qui se retire sur le gabarit PDMS se situe dans la plage optimale, entre 30 et 60°.
5. Chargez la suspension bactérienne dans une seringue de 1 mL et connectez la seringue à la puce à l’aide d’un tube microfluidique.
   1. Pour sécuriser la connexion entre la seringue et la tubulure, insérez directement une aiguille d’un diamètre extérieur de 0,6 mm dans la tubulure. Pour éviter de disperser toute suspension restante à proximité de l’entrée à travers le canal, rincez le fluide frais à travers le trou utilisé comme sortie pendant le processus de structuration (figure 2A-III), plutôt que le trou utilisé comme entrée.
   2. Montez la seringue sur la pompe à seringue et injectez la suspension dans la puce microfluidique par l’entrée située dans la partie amont du canal jusqu’à ce que la suspension recouvre la région du modèle avec des pièges. NOTE: Pendant le processus d’injection de liquide, l’air peut s’échapper par une sortie située à l’extrémité aval du canal.
   3. Régler le pousse-seringue pour retirer la suspension bactérienne (Figure 2A-I) à un débit de 0,07 à 0,2 μL/min, ce qui, dans la géométrie décrite, correspond à une vitesse de recul du ménisque de 80 à 100 μm/min.
   4. Surveillez le processus de structuration à l’aide d’un logiciel de microscope.
      NOTE: Ici, un grossissement de 10x a été utilisé pour surveiller le ménisque fuyant sur le modèle, et un grossissement de 20x a été utilisé pour surveiller le dépôt de bactéries individuelles dans les pièges microfabriqués.
6. Une fois que le modèle a été structuré avec des cellules (Figure 2A-II), augmentez le débit de prélèvement pour vider rapidement le canal microfluidique et le rincer avec du LB frais qui a été préalablement dégazé pendant au moins 30 min et préchauffé à 30 °C.
7. Réglez le pousse-seringue à un débit de 2 μL/min pour rincer doucement le canal. Une fois le canal rempli, augmentez le débit (15 μL/min) en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
8. Acquérez des images de bactéries en croissance à la grosseur et à l’intervalle de temps souhaités.

Résultats

Figure 1 : Schéma de la plate-forme pour l’assemblage séquentiel assisté par capillarité dans un canal microfluidique. (A) Incubateur de boîtes. L’incubateur à boîte maintient une température uniforme et constante (ici, 30 °C) à l’intérieur ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD Seringue de 10 mL (Luer-Lock)	BD	300912	Utilisé pour rincer le bouillon de lysogénie frais dans le canal microfluidique
Incubateur Box	Services d’imagerie de vie		Utilisé pour assurer une température uniforme et constante dans le canal
Centrifugeuse	Eppendorf	5424R	Utilisé pour remplacer le support de nuit par un support minimal frais
Flacon à centrifuger	Eppendorf	30120086	1,5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		Pousse-seringue
CONTRÔLEUR H401-T	Okolab		Contrôleur de la plaque de verre chauffée
H601-NIKON-TS2R-VERRE	Okolab		Plaque de verre chauffée
Seringues à insuline, U 100, avec luer	Codan Medical ApS	CODA621640	Seringue de 1 mL utilisée pour retirer la suspension liquide pendant le processus de modelage
Bouillon LB, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Bouillon de lysogénie rincé dans le canal microfluidique
Tube de transfert Masterflex	Masterflex	HV-06419-05	0,020 '' ID, 0,06 '' OD
MOPS (10x)	Teknova	Référence M2101	Dilué dix fois avec de l’eau milliQ et utilisé pour remplacer le milieu de nuit
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Phosphate de potassium dibasique	Sigma Aldrich	Réf. P3786	Ajouté aux MOPS 1x
Préadolescent 20	Sigma Aldrich	Réf. P1379	Utilisé pour assurer un angle de contact optimal pendant le processus de structuration