Dosage par biocapteur bactérien pour la détection du mercure biodisponible dans des conditions anaérobies

Résumé

Source : Stenzler, B. R. et al., Un essai de biocapteur anaérobie pour la détection du mercure et du cadmium. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’utilisation de biocapteurs bactériens génétiquement modifiés pour mesurer avec précision la fraction biodisponible des ions mercure dans des conditions anaérobies. En faisant varier la concentration de sulfate de magnésium, le test garantit que le biocapteur répond de manière sélective aux ions mercure libres, comme l’indiquent les changements d’intensité de fluorescence.

Protocole

1. Dosage de l’exposition

1. Conception d’un agencement de plaques.
   NOTE: Assurez-vous que toutes les valeurs de pipetage sont calculées et que les stocks sont préparés avant de commencer le test d’exposition. La façon de concevoir correctement une expérience et les contrôles à inclure sont détaillés dans le texte. De plus, l’expérience ne doit pas être démarrée s’il y a de l’oxygène dans la chambre anaérobie indiquée sur le moniteur anaérobie.
2. Concevez la disposition des plaques selon un gabarit à 96 puits. Cela permettra d’effectuer des expériences avec 32 traitements différents dans des répétitions techniques de 3, ce qui est mieux représenté par une grille 4 x 8 pour mettre en place des flacons (voir figure 1).

NOTE: Lors de l’essai du rôle d’une variable sur l’absorption de mercure à l’aide du biocapteur inductible au mercure, deux traitements sont nécessaires pour chaque variable : le traitement (biocapteur + mercure (Hg) + variable + nitrate) et son blanc de traitement (biocapteur + variable + nitrate). Lors du test du rôle d’une variable sur la physiologie de la cellule à l’aide du biocapteur constitutif, deux traitements sont nécessaires pour chaque variable : le traitement (biocapteur + Hg + variable + nitrate) et le blanc de traitement (biocapteur + variable + Hg). Le mercure peut être remplacé par du cadmium (Cd). Hg ou Cd deviendra la variable lors de l’exécution d’une courbe d’étalonnage. Il n’est pas nécessaire que les biocapteurs constitutifs et inductibles fonctionnent en même temps (dans la même disposition de plaques). Le tableau 1 fournit un exemple de modèle pour la disposition des plaques et la grille 4 x 8 correspondante lors de l’essai d’une plage de concentration de magnésium (variable).

2. Configurez la grille 4 x 8 selon la disposition de la plaque de test.

1. Placez des flacons standard de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 7 ml dans le plateau.
NOTE: Les flacons en PTFE doivent être lavés à l’acide ou stérilisés à la chaleur avant d’être utilisés. Ils ne doivent être manipulés qu’en manipulant l’extérieur du flacon.

2. À chaque flacon, ajoutez le volume du milieu d’exposition correspondant à chaque traitement.
NOTE: Dans le cas d’une exposition d’un volume total de 2 000 μL (2 mL), le milieu d’exposition ajouté sera le suivant : milieu d’exposition μL = 2 000 μL – traitement (blanc) μL. (p. ex., milieu d’exposition μL = 2 000 – 100 μL (biocapteur) – 40 μL (nitrate) – 100 μL (Hg) – 100 μL (variable (p. ex., sulfate de magnésium, MgSO₄)) = 1660 μL). Assurez-vous que le volume ajouté de la variable testée ne dépasse pas 5 % (100 μL) du volume final.

3. Ajouter le volume correspondant de la solution de la variable chimique à tester à chaque flacon, selon la disposition de la plaque.

4. Ajouter du nitrate dans chaque flacon de manière à ce que la concentration finale soit de 200 μM (40-80 μL). Exclure cette étape pour les ébauches de traitement constitutifs des biocapteurs.

5. Ajoutez du Hg (5 nM lors du test d’une variable) ou du Cd (300 nM lors du test d’une variable) dans les flacons selon la disposition de la plaque. Exclure cette étape pour les ébauches de traitement par biocapteur inductibles au mercure.

1. Lorsque vous utilisez du Hg, prenez le bouillon de 4 à 8 μM et agitez bien. Diluer la solution dans un milieu d’exposition dans un flacon de 7 mL de PTFE à 100-250 nM pour obtenir une solution de Hg fonctionnelle. À partir de cette solution de travail, ajoutez du mercure aux flacons requis. Dans ce cas, une courbe d’étalonnage de Hg allant de 0 à 12,5 nM.
NOTE: Lorsque vous testez l’effet d’une variable sur la biodisponibilité du Hg ou du Cd, assurez-vous que le [Hg] ou le [Cd] reste constant dans tous les traitements. Lors de l’ajout de Hg ou de Cd, assurez-vous d’utiliser une pointe de pipette, mais ne touchez jamais le milieu d’exposition dans les flacons.

Secouez manuellement dans un mouvement orbital.
NOTE: L’expérience peut être interrompue maintenant en fonction du temps nécessaire pour que le mercure ou le cadmium se spécifie en solution. Si vous laissez agir pendant plus d’une heure, placez des bouchons en PTFE sur les flacons en PTFE pour éviter l’évaporation ou la contamination.

Pipetez doucement le stock de biocapteurs d’avant en arrière pour assurer l’homogénéité. Ajouter 100 μL de biocapteur dans chaque flacon. Secouez orbitalement manuellement.

Préparez le lecteur de plaques pour qu’il se réchauffe pour la lecture avec les critères suivants : température à 37 °C, fonctionnement cinétique pendant 10 heures avec lectures toutes les 2,5 à 5 minutes avec agitation orbitale entre les lectures, et mesures de fluorescence avec une excitation de fluorescence de 440 nm et une émission de 500 nm.

Pipeter 200 μL de chaque flacon en PTFE de la grille 4 x 8 dans les puits correspondants de la plaque à 96 puits (microplaques noires, à fond transparent à 96 puits, à surface non liante). Pipetez la pipette d’avant en arrière cinq fois avant de transférer chaque 200 μL.REMARQUE : Au lieu de jeter la pointe de la pipette, laissez-la dans le flacon en PTFE pour suivre la progression du pipetage.

Placez la plaque à 96 puits dans le plateau du lecteur de plaques, puis placez le couvercle sur la plaque à 96 puits et commencez le test.

 

Tableau 1 : Exemple de disposition de plaque pour l’utilisation du biocapteur afin de tester la biodisponibilité du mercure (5 nM) sur un gradient de magnésium (0-10 mM)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

un

Biocapteur induit par le mercure + mercure + nitrate + 0 mM Mg

Biocapteur induit par le mercure + nitrate + 0 mM Mg

Biocapteur constitutif + Hg + Nitrate + 0 mM Mg

Biocapteur constitutif + Hg + 0 mM mg

b

Biocapteur induit par le mercure + mercure + nitrate + 0,1 mM mg

Biocapteur induit par le mercure + nitrate + 0,1 mM Mg

Biocapteur constitutif + Hg + Nitrate + 0,1 mM mg

Biocapteur constitutif + Hg + 0,1 mM Mg

c

Biocapteur induit par le mercure + mercure + nitrate + 1 mM Mg

Biocapteur induit par le mercure + nitrate + 1 mM Mg

Biocapteur constitutif + Hg + Nitrate + 1 mM Mg

Biocapteur constitutif + Hg + 1 mM Mg

d

Biocapteur induit par le mercure + mercure + nitrate + 10 mM mg

Biocapteur induit par le mercure + nitrate + 10 mM Mg

Biocapteur constitutif + Hg + nitrate + 10 mM mg

Biocapteur constitutif + Hg + 10 mM Mg

Matériaux