Inhibiteurs de criblage de la pyrophosphatase liée à la membrane bactérienne à l’aide d’un dosage colorimétrique

Résumé

Source : Vidilaseris, K., et al. Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase liés à la membrane de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo présente un test colorimétrique pour dépister les inhibiteurs de la pyrophosphatase liée à la membrane bactérienne (mPPase) en quantifiant la libération d’orthophosphate. La méthode permet d’identifier des composés qui inhibent la mPPase de Thermotoga maritima, une cible potentielle de médicament antimicrobien.

Protocole

1. Réactifs pour la préparation du dosage

1. Préparez la solution d’arsénite-citrate.
   1. Peser 5 g d’arsénite de sodium et 5 g de citrate trisodique dihydraté.
      PRUDENCE: L’arsénite de sodium est toxique ; Utilisez donc un équipement de protection approprié et manipulez-le avec un soin particulier. Par mesure de précaution, ne pas manipuler avant d’avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité nécessaires. Manipulez uniquement dans une hotte afin de ne pas inhaler la poussière/vapeurs du composé ou de sa ou ses solutions. En cas d’inhalation, allez à l’air frais et obtenez des soins médicaux. Portez des lunettes de sécurité chimique, des gants de protection et des vêtements appropriés pour éviter l’ingestion et le contact avec les yeux et la peau. En cas d’ingestion, appelez immédiatement un centre antipoison ou un médecin. S’il entre en contact avec la peau ou dans les yeux, lavez-vous abondamment à l’eau et consultez un médecin.
   2. Dissoudre dans 100 mL d’eau.
   3. Ajouter 5 ml d’acide acétique glacial, mélanger et ajouter de l’eau à 250 ml.
   4. Conserver à température ambiante, à l’abri de la lumière.
      NOTE: La solution est stable depuis plus d’un an.
2. Préparez la solution A et la solution B.
   1. Pour la solution A, ajouter 10 mL de HCl (acide chlorhydrique) 0,5 M glacé à 0,3 g d’acide ascorbique. Dissoudre l’acide ascorbique par vortex.
   2. Pour la solution B, ajoutez 1 mL d’eau glacée à 70 mg d’heptamolybdate d’ammonium tétrahydraté et agitez le vortex pour dissoudre.
      NOTE: Conservez les deux solutions sur de la glace jusqu’à utilisation. Pour assurer la cohérence du résultat du dosage, les deux solutions peuvent être stockées sur de la glace pendant une semaine maximum.
3. Préparez l’étalon de phosphate (Pi) avec la concentration de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM et 500 μM pour l’étalonnage.
   1. Ajouter 0 μL, 25 μL, 50 μL et 100 μL de 5 mM Na₂HPO₄ (phosphate disodique) dihydraté dans quatre microtubes contenant 370 μL du mélange réactionnel.
   2. Remplissez jusqu’à 1 mL d’eau.

2. Dosage de l’activité d’une plaque de 96 puits

NOTE: Voir la figure 1 pour le flux de travail schématique du test.

1. Ajouter 1 mL de solution B à 10 mL de solution A, mélanger par vortex et conserver la solution sur de la glace.
   NOTE: Cette solution doit être transparente et jaune. Conservez la solution A + B sur de la glace pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser. Cependant, utilisez la solution dans les 3 heures car elle se détériorera après un stockage à long terme.
2. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 40 μL d’étalons 0 μM, 62,5 μM, 250 μM et 500 μM Pi aux bandelettes tubulaires.
   NOTE: Le mélange réactionnel sans ajout de Pi sera utilisé comme une ébauche.
3. Ajouter 25 μL de solution composée dans les bandes tubulaires à l’aide d’une pipette multicanaux.
   NOTE: Chaque composé a trois concentrations différentes en trois exemplaires, ce qui est suffisant pour l’estimation initiale de la concentration inhibitrice demi-maximale (CI50). Pour une détermination plus précise de la CI50, huit concentrations de composés différentes peuvent être utilisées. Pour l’enzyme non inhibée, la solution composée est remplacée par une quantité égale d’eau. Comme témoins positifs, 2,5 μM, 25 μM et 250 μM de sel de sodium imidodiphosphate (IDP) ont été utilisés.
4. Ajouter 15 μL de mélange de solution de mPPase (pyrophosphatase liée à la membrane) dans les bandes de tubes (à l’exception des tubes contenant l’étalon Pi) à l’aide d’une pipette multicanaux.
5. Scellez les bandes tubulaires avec une feuille d’étanchéité adhésive. Coupez la feuille d’étanchéité pour séparer chaque bande de tube.
6. Pré-incuber les échantillons pendant 5 min à 71 °C. Placer les échantillons sur le bloc chauffant avec un intervalle de 20 s entre chaque bande afin de minimiser la consommation de temps lors des étapes suivantes.
7. Pour chaque bande, ouvrez le joint adhésif. Ajouter 10 μL de pyrophosphate dibasique de sodium de 2 mM à l’aide d’une pipette multicanaux et mélanger en pipetant de haut en bas pendant 5 ×. Scellez à nouveau la bande tubulaire en utilisant le même étanchéité.
   NOTE: Cette étape peut être difficile à accomplir au départ en 20 secondes ; Cependant, cela deviendra plus facile après certains dosages.
8. Incuber à 71 °C pendant 5 min.
9. Placer les échantillons sur l’appareil de refroidissement avec un intervalle de 20 s entre chaque bandelette. Laissez-les refroidir pendant 10 min mais centrifugez brièvement chaque bande après 5 min de refroidissement, pour décanter les gouttes d’eau sous la feuille d’étanchéité, puis remettez-la dans l’appareil de refroidissement et retirez l’étanchéité.
   NOTE: L’appareil de refroidissement peut être simplement fabriqué en plaçant une plaque PCR (réaction en chaîne par polymérase) à 96 puits sur une boîte de Pétri en polystyrène (taille 150 mm × 15 mm) remplie d’eau et congelée pendant au moins 1 h. L’appareil doit être sorti du congélateur environ 5 minutes avant le début du test. Ne retirez pas l’appareil de refroidissement juste avant le refroidissement de l’échantillon, car cela gèlerait le mélange réactionnel et entraverait le développement de la couleur.
10. Après 10 min de refroidissement, ajouter 60 μL de solution A + B, mélanger en pipetant de haut en bas pendant 5 × et maintenir les bandes tubulaires sur l’appareil de refroidissement pendant 10 min.
11. Ajouter 90 μL de la solution d’arsénite-citrate et conserver à température ambiante pendant au moins 30 min pour produire une couleur bleue stable.
    PRUDENCE: En raison de sa toxicité, toutes les solutions contenant de l’arsénite de sodium doivent être manipulées avec un soin particulier à tout moment. Ainsi, l’ajout d’une solution d’arsénite-citrate doit se faire dans une hotte.
12. Versez 180 μL de chaque mélange réactionnel dans une microplaque de polystyrène transparent à 96 puits.
13. Mesurer l’absorbance de chaque puits à 860 nm à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques.

Résultats

Figure 1 : Schéma de travail de l’essai d’inhibition de la TmPPase dans un format de plaque à 96 puits. La numérotation rouge indique les étapes du test selon le protocole, et les flèches bleues indiquent l’ordre des intervalles. TmPPase : m...

Matériaux