Visualisation des protéines de germination dans la membrane interne de spores bactériennes

Résumé

Source : Wen, J., Pasman, et. al., Visualisation des germinosomes et de la membrane interne dans les spores de Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie à éclairage structuré pour acquérir des images de fluorescence tridimensionnelles qui révèlent l’organisation des protéines de germination au sein de la spore bactérienne.

Protocole

1. Imagerie des protéines de germination (durée : 1 h)
   1. Capturez les images de transmission et de fluorescence des spores ainsi que d’un mélange de microsphères fluorescentes modifiées au carboxylate rouge et jaune-vert sur un microscope à illumination structurée (voir le tableau des matériaux) équipé d’un objectif à huile 100x (ouverture numérique = 1,49), d’une caméra CCD (dispositif à couplage de charge) et d’un logiciel d’analyse d’images (voir le tableau des matériaux). Générez toutes les images à température ambiante sans être perturbé par la lumière ambiante. Assurez-vous de toujours nettoyer l’objectif 100x et la lame avec de l’éthanol à 75 % avant l’imagerie.
   2. Faites la mise au point sur des microsphères fluorescentes de 100 nm (diamètre) et optimisez la fonction d’étalement du point (psf) en ajustant la bague de correction sur l’objectif 100x jusqu’à l’obtention d’une psf symétrique, minimisant ainsi le flou de l’image. La psf est la réponse impulsionnelle ou la réponse d’un système d’imagerie à une source ponctuelle ou à un objet ponctuel.
   3. Sélectionnez un champ de vision avec environ 10 microsphères fluorescentes rondes. Appliquez un réglage de la mise au point du réseau pour les longueurs d’onde d’excitation de 561 nm et 488 nm comme guide pour le logiciel d’analyse d’image.
   4. Focalisez les spores avec la lumière de transmission et capturez une image de lumière de transmission en mode moyen de 16× avec des expositions de 200 ms pour chaque image.
   5. Capturez des images fluorescentes brutes 3D-SIM des spores avec le mode d’éclairage « 3D-SIM », les paramètres de l’appareil photo pour le mode de lecture Gain multiplicateur d’électrons (EM) 10 MHz à 14 bits et gain EM à 175. Expulsez la sonde FM4-64 dans les spores PS4150 avec une lumière laser de 561 nm à 20 % de puissance laser et un temps d’éclairage de 400 ms.
   6. Excité le GerKB-mCherry et le GerD-GFP dans les spores KGB80 avec, respectivement, une lumière laser de 561 nm à une puissance laser de 30 % pendant 1 s et une lumière laser de 488 nm à une puissance laser de 60 % pendant 3 s. Les paramètres Z-Stack sont en mode de haut en bas, 0,2 μm/pas.
      NOTE: Ces paramètres laser ont été appliqués pour assurer une valeur de luminosité maximale d’environ 4 000 pour la fenêtre de l’histogramme.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames de verre séchées à l’air	Menzel Gläser	630-2870
Objectif huile APO TIRF N20R8 100× (NA=1,49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE ::spc, ΔcotE ::tet)
FluoSpheres Microsphères modifiées au carboxylate	Invitrogen, 0,1 μm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	Référence F34653
Histodenz : milieu à gradient de densité non ionique	Sigma-Aldrich	D2158
Image J
Caméra CCD iXON3 DU-897 X-6515	Technologie Andor		https://imagej.net/Welcome
Logiciel d’imagerie microscope	Nikon, Japon	NIS-Element AR 4.51.01
Eau déminerilzée ultra-pure MilliQ	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Microscope Nikon Eclipse Ti
Lamelles de précision	Paul Marienfeld	117650
Tubes à bouchon à vis 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM