Transfection d’amibes de type sauvage par électroporation avec support d’alimentation bactérienne

Résumé

Source : Paschke, P., et al. Génie génétique des cellules de Dictyostelium discoideum basé sur la sélection et la croissance sur des bactéries. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre la procédure d’introduction d’un plasmide portant un gène cible dans les cellules d’amibes par électroporation, suivie d’une récupération dans un supplément bactérien pour permettre une livraison efficace de gènes dans les amibes de type sauvage.

Protocole

1. Configuration des cellules Dictyostelium pour la transfection
   1. Cultivez Klebsiella aerogenes jusqu’à la confluence dans un milieu SM (lait écrémé) (milieu riche en nutriments) pendant la nuit à RT (température ambiante). Les cultures peuvent être conservées jusqu’à 2 semaines à 4 °C.
   2. Ajouter environ 400 μL de cette suspension bactérienne sur une plaque de gélose SM (peptone 10 g/L ; extrait de levure 1 g/L ; glucose 10 g/L ; KH₂PO₄ 1,9 g/L ; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L ; MgSO₄ anhydre 0,49 g/L ; 1,7 % d’agar) et étaler uniformément. Prenez une boucle stérile et inoculez avec des cellules de Dictyostelium . Étalez les cellules sur un bord de la plaque.
   3. Incuber la plaque à 22 °C pendant 2 jours pour assurer des zones de croissance suffisamment grandes pour la transfection.
      NOTE: Pour les souches de Dictyostelium qui ne font pas de grandes zones de croissance (par exemple, Ax3, DH1 ou JH10), ou pour les expérimentateurs inexpérimentés, utilisez plutôt des plaques de nettoyage.
   4. Prenez une boucle stérile et inoculez avec des cellules Dictyostelium (environ 2-4 x 10⁵ cellules). Transférez les cellules à 800 μL d’une suspension dense de K. aerogenes dans SM. Mélangez les cellules en pipetant de haut en bas.
   5. Transférer 400 μL, 200 μL, 100 μL et 50 μL sur des plaques de gélose SM fraîches. Ajouter à chaque plaque 400 μL de suspension supplémentaire de SM K. aerogenes , étaler uniformément et sécher.
   6. Incuber les plaques à 22 °C pendant environ 2 jours jusqu’à ce qu’elles deviennent translucides.
      NOTE: En raison de leur taux de croissance plus rapide, les bactéries produisent d’abord une pelouse confluente, et les amibes « nettoient » ensuite la plaque des bactéries. Le temps nécessaire à ce processus peut varier en fonction du contexte de la souche et de la capacité des cellules mutantes à se développer sur les bactéries.

2. Transfection des cellules de dictyostelium basée sur la sélection bactérienne

1. Pour préparer des plaques avec une suspension de K. aerogenes , ajoutez 10 mL de tampon SorMC contenant des bactéries K. aerogenes à une densité de DO (densité optique) ₆₀₀ = 2 (ajoutez 200 μL de la solution mère de DO₆₀₀ = 100 K. aerogenes préparée pour la concentration de bactéries souhaitée) dans une boîte de Pétri de 10 cm traitée pour culture tissulaire.
   NOTE: Cette plaque est plus tard nécessaire pour cultiver les cellules transfectées de D. discoideum . Alternativement, une plaque de culture tissulaire à 6 puits peut être utilisée. Dans le cas de la transfection des plasmides extrachromosomiques, la plaque de culture tissulaire à 6 puits est plus économe en ressources. Utiliser 2 mL de suspension SorMC de K. aerogenes (OD₆₀₀ = 2) par puits.
2. Préparation des cellules Dictyostelium
   1. À l’aide d’une boucle d’inoculation jetable de 10 μL, grattez les cellules des zones de croissance (environ 3 cm) de la plaque de culture (bord de la zone nettoyée) ou de la plaque d’élimination. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de tampon H40 glacé.
      NOTE: Le moment de la récolte des cellules des plaques transparentes est crucial. Une récolte trop précoce produit une quantité trop faible de cellules, tandis qu’une récolte trop tardive augmente le risque de produire des cellules partiellement développées.
   2. Lavez les cellules en les faisant tourner pendant 2 minutes à 1 000 x g ou en les faisant tourner pendant 2 s à 10 000 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le tampon H40 jusqu’à une densité finale de 2-4 x 10⁷ cellules/mL. Gardez les cellules froides pendant toute la procédure de transfection. Utilisez une boue d’eau glacée pour assurer un contact direct entre les tubes et la glace.
3. Électroporation
   1. Ajoutez 100 μL de cellules dans un tube avec 1 à 2 μg d’ADN (acide désoxyribonucléique). Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas.
   2. Transférez le mélange cellule/ADN dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie (espace de 2 mm).
   3. Pulsez les cellules à l’aide des paramètres d’onde carrée suivants : 350 V, 8 ms, 2 impulsions et 1 s d’intervalle d’impulsion.
      NOTE: N’ajoutez pas plus de 2 μg d’ADN. Des quantités plus élevées sont toxiques pour les cellules et diminuent l’efficacité de la transfection. Le volume total d’ADN ajouté ne doit pas dépasser 5 μL.
   4. Transférez immédiatement les cellules dans la boîte de Pétri de 10 cm préparée au préalable avec K. aerogenes SorMC et laissez les cellules récupérer pendant 5 heures.
      NOTE: Vérifiez les cellules de la boîte de Pétri à l’aide d’un microscope inversé. Les cellules apparaîtront rondes directement après l’électroporation, mais reprendront leur forme amiboïde après environ 30 minutes, lorsqu’elles auront eu suffisamment de temps pour se fixer correctement à la surface.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microcentrifugeuses Eppendorf 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Centrifugeuses Eppendorf 5702R avec rotor modèle A-4-38	ThermoScientific	12823252
Armoire de sécurité Foruna - SCANLAF	Labogène
BioPhotomètre Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Gélose purifiée	Oxoïde	LP0028 (en anglais)
Bouillon SM	Formedium	SMB0102
2x LB de bouillon	Formedium	LBD0102
Acide libre HEPES	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Acide folique	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
Plat de culture tissulaire de style 100 x 20 mm, traité pour la culture tissulaire	Corning Incorporated	353003
Cuvettes d’électroporation à espace de 2 mm, électrode longue	Geneflow Limited	Référence E6-0062
Boucle d’inoculation de 10 μl, bleu 10 micro L	ThermoScientific	129399
Épandeur, en forme de L, stérile	Greiner Bio-One	730190