Enrichissement de lipoprotéines bactériennes à l’aide d’une séparation de phase détergente non ionique

Résumé

Source : Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation de lipopeptides N-terminaux pour la détermination structurale par spectrométrie de masse. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’enrichissement des lipoprotéines bactériennes à l’aide d’un détergent non ionique qui subit une séparation de phase lors du réchauffement. Grâce à des changements de température séquentiels et à des étapes de centrifugation, les lipoprotéines sont sélectivement réparties dans la phase détergente, tandis que les contaminants non lipoprotéiques sont éliminés. Les lipoprotéines enrichies sont ensuite précipitées, lavées et remises en suspension pour des applications en aval.

Protocole

1. Enrichissement des lipoprotéines par répartition de phase du Triton X-114 (TX-114)

1. Compléter le lysat bactérien avec le tensioactif TX-114 jusqu’à une concentration finale de 2 % (vol/vol) en ajoutant un volume égal de tensioactif à 4 % (vol/vol) dans une solution saline/éthylènediaminetétraacétique tamponnée au Tris (TBSE) et incuber sur de la glace pendant 1 h, en mélangeant par inversion toutes les ~15 min.
   NOTE: Lorsqu’ils sont refroidis, le surnageant et le tensioactif seront miscibles.
2. Transférez le tube dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant 10 min pour induire la séparation de phase. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 10 min à température ambiante pour maintenir la séparation biphasique.
3. Pipetez doucement la phase aqueuse supérieure et jetez-la. Ajoutez du TBSE glacé à la phase tensioactive inférieure pour remplir le tube à son volume d’origine et retournez-le pour mélanger. Incuber sur glace pendant 10 min.
4. Transférez le tube dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant 10 min pour induire la séparation de phase, puis centrifugez à 10 000 x g pendant 10 min à température ambiante.
5. Répétez les étapes 1.3-1.4 une fois de plus pour un total de 3 séparations. Retirez la phase aqueuse supérieure et jetez-la.
6. Retirer les pastilles de protéines précipitées qui se sont formées au cours des extractions (visibles au fond du tube), en ajoutant 1 volume de TBSE glacé à la phase tensioactive. Centrifuger à 4 °C à 16 000 x g pendant 2 min pour granuler les protéines insolubles.
   NOTE: L’échantillon doit rester monophasé. En cas de séparation de phase, refroidissez à nouveau l’échantillon et centrifugez-le à nouveau. La pastille est généralement composée de contaminants non lipoprotéiques, mais peut être conservée pour une analyse plus approfondie.
7. Transférez immédiatement le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 2,0 mL contenant 1250 μL d’acétone à 100 %. Pipetez soigneusement de haut en bas pour laver l’échantillon de la pointe car il sera visqueux. Mélanger par inversion et incuber toute la nuit à -20 °C pour précipiter les protéines.
8. Centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 20 min à température ambiante pour granuler les lipoprotéines en faisant attention à l’orientation du tube. Les lipoprotéines formeront une fine pellicule blanche le long de la paroi externe du tube.
9. Lavez le granulé deux fois avec de l’acétone à 100 %. Carafer l’acétone et laisser sécher l’échantillon à l’air.
10. Ajoutez 20 à 40 μL de chlorhydrate de Tris 10 mM, pH 8,0 ou un tampon d’échantillon standard Laemmli SDS-PAGE et remettez soigneusement en suspension en pipetant de haut en bas contre la paroi avec les lipoprotéines précipitées. Grattez le côté du tube avec la pointe de la pipette pour déloger les lipoprotéines.
    NOTE: Les lipoprotéines ne se dissolvent pas dans le tampon Tris mais forment plutôt une suspension.
    1. Conservez les lipoprotéines à -20 °C jusqu’à l’utilisation.

Matériaux