Purification de protéines recombinantes à domaine P dérivées de bactéries de norovirus humains

Résumé

Source : Leuthold, M. M., et al. Production de domaines saillants de norovirus humains chez E. coli pour la cristallographie aux rayons X. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo démontre la purification du domaine P du norovirus humain recombinant à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique, mettant en évidence la séparation de la protéine cible des impuretés de poids moléculaire supérieur et inférieur en fonction de l’accessibilité différentielle des pores. Le processus est surveillé par l’absorbance UV et confirmé par l’analyse SDS-PAGE des fractions éluées.

Protocole

1. 3ème étape de purification

1. Laver les pompes et les tuyaux du système de purification HPLC (chromatographie liquide haute performance) et pré-équilibrer la colonne SEC (chromatographie d’exclusion stérique) (voir liste des matériaux) avec GFB (tampon de filtration sur gel).
2. Injecter le domaine P dans la colonne à un débit de 1 ml/min à l’aide d’une superloop (jusqu’à 12 ml) ou d’une boucle (jusqu’à 3 ml), en fonction du volume de l’échantillon concentré. Une fois l’injection terminée, augmentez le débit à 2,5 ml/min.
3. Au fur et à mesure que la DO (densité optique) augmente et que le domaine P se détache de la colonne, prélevez des fractions de 1,5 ml. Vérifiez les fractions à l’aide de SDS-PAGE avec un gel à 12 % (figures 1A et 1B). Ne regroupez que les fractions les plus pures et concentrez-vous à ~ 3 mg/ml et ~ 8 mg/ml.
   Remarque : Après ~110 ml (volume de vide), la plupart des impuretés sont éluées à partir d’une colonne SEC avec un volume de lit de 320 ml. Le domaine P est généralement élué sous forme de dimère. Le temps/volume d’élution du dimère du domaine P dépend de la note de préparation (pg) de la colonne SEC.

Résultats

Graphique 1. Résultats schématiques et représentatifs pour la 3ème étape de purification.
Chromatogramme de l’élution du domaine P à l’aide de la SEC et du résultat SDS-PAGE correspondant. Les chiffres noirs indiquent les fractions qui so...

Matériaux