Purification sélective d’une protéine bactérienne par chromatographie échangeuse d’ions négatifs

Résumé

Source : Kuo, T., et al. Purification chromatographique négative en une étape de la protéine activatrice des neutrophiles d’Helicobacter pylori surexprimée chez Escherichia coli en mode batch. J. Vis. Exp. (2016)

La vidéo fait la démonstration d’une technique de chromatographie négative permettant de purifier une protéine associée à la virulence à partir d’un lysat bactérien. En utilisant une résine chargée positivement dans une solution tamponnée, les protéines de la cellule hôte sont sélectivement conservées, tandis que la protéine cible presque neutre reste non liée et est collectée dans le flux. Cette méthode permet une séparation et une récupération efficaces de la protéine cible pour les applications en aval.

Protocole

1. Expression de HP-NAP recombinant chez Escherichia coli (E. coli)

1. Préparez le plasmide pET42a-NAP contenant la séquence d’ADN de la protéine activatrice des neutrophiles d’Helicobacter pylori (HP-NAP) de la souche H . pylori 26695 comme décrit précédemment. Préparez les plasmides contenant la séquence d’ADN de HP-NAP avec les mutations ponctuelles souhaitées.
2. Transformez 10 ng des plasmides d’ADN ci-dessus en cellules compétentes pour E. coli BL21 (DE3) par choc thermique pendant 45 secondes à 42 °C, striez les cellules sur des plaques de gélose à bouillon de lysogénie (LB) contenant 50 μg/ml de kanamycine et incubez les plaques à 37 °C pendant 16 heures.
3. Inoculer des colonies individuelles dans des tubes individuels contenant 5 ml de bouillon LB avec 50 μg/ml de kanamycine et les cultiver en précultures à 37 °C pendant 16 heures en agitant à 170 tr/min.
4. Injecter 2 ml des cellules de préculture ci-dessus dans 200 ml de bouillon LB contenant 50 μg/ml de kanamycine dans une fiole de 1 L. Incuber le ballon de culture inoculé à 37 °C pendant 2 heures en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce que l’absorbance à 600 nm atteigne environ 0,4-0,5 détectée par un spectrophotomètre ultraviolet-visible (UV/VIS).
5. Ajouter 80 μl d’isopropyle 1 M β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans la culture ci-dessus jusqu’à une concentration finale de 0,4 mM pour induire l’expression de HP-NAP. Incuber la culture pendant 3 heures jusqu’à ce que l’absorbance à 600 nm atteigne environ 1,6-1,7.
6. Centrifuger les cellules à 6 000 x g à 4 °C pendant 15 min pour éliminer le surnageant. Conservez la pastille cellulaire à -70 °C jusqu’à la purification.

2. Préparation de la fraction protéique soluble contenant HP-NAP

NOTE: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 °C.

1. Remettre en suspension 50 ml de la pastille cellulaire préparée à l’étape 1.6 du Protocole dans 20 ml de Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM de NaCl contenant 0,13 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,03 mM de N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chlorométhylcétone (TLCK) et 0,03 mM de N-tosyl-L-phénylalaninyl-chlorométhylcétone (TPCK) à 4 °C comme décrit précédemment.
2. Perturber les cellules bactériennes en faisant passer la suspension bactérienne dans un homogénéisateur à haute pression fonctionnant à une plage de 15 000 à 20 000 psi pendant 7 fois à 4 °C.
3. Centrifugez le lysat cellulaire à 30 000 × g à 4 °C pendant 1 heure pour séparer les fractions protéiques solubles et insolubles à l’aide d’une ultracentrifugeuse. Transférez le surnageant sous forme de fraction protéique soluble dans un bécher.
4. Mesurer la concentration en protéines de la fraction protéique soluble par la méthode de Bradford à l’aide d’une trousse commerciale contenant de l’albumine sérique bovine (BSA) comme étalon, conformément aux instructions du fabricant.
5. Ajouter 177,6 μl de HCl 1 N dans 20 ml de la fraction protéique soluble obtenue à l’étape 2.3 du protocole pour ajuster sa valeur de pH de 9,0 à pH 8,0.
6. Ajouter 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à la solution protéique ci-dessus pour obtenir la concentration finale en protéines de 0,5 mg/ml.

3. Purification de HP-NAP recombinant d’E . coli par chromatographie discontinue en mode négatif avec des résines échangeuses d’ions DEAE

1. Préparez 15 ml de résines de diéthylaminoéthyle (DEAE).
   1. Peser 0,6 g de poudre sèche de résines DEAE et la suspendre dans 30 ml de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à température ambiante pendant au moins 1 jour.
   2. Centrifuger la résine à 10 000 x g à 4 °C pendant 1 min.
   3. Retirez et jetez le surnageant.
   4. Ajouter 15 ml de Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0, 50 mM de NaCl.
   5. Répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.4 du protocole quatre fois de plus.
   6. Conserver les 15 ml de résine décantée (50 % de boue dans un tampon Tris de 30 ml) à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
      NOTE: Toutes les étapes suivantes sont effectuées à 4 °C.
2. Ajouter 45 ml des protéines solubles préparées à l’étape 2.6 du protocole pour 15 ml de résine et mélanger la suspension protéine/résine à l’aide d’un agitateur magnétique à 4 °C pendant 1 heure.
3. Versez la suspension protéique/résine dans une colonne en plastique ou en verre munie d’un robinet d’arrêt. Laissez la résine se déposer sous l’effet de la gravité.
4. Ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre à la solution protéique de s’écouler dans la colonne par gravité jusqu’à ce que le niveau de liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Collectez le flux sous forme de fraction non liée, qui contient le HP-NAP purifié.
5. Ajouter 15 ml de Tris-HCl 20 mM glacé, pH 8,0, 50 mM NaCl dans la colonne.
6. Ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre au tampon de lavage de traverser la colonne par gravité jusqu’à ce que le niveau de liquide dans la colonne soit juste au-dessus de la résine. Récupérez le flux continu en tant que fraction de lavage.
7. Répétez les étapes 3.5 à 3.6 du protocole quatre fois de plus pour collecter les fractions de lavage supplémentaires.

Matériaux