Procédure de purification d’une protéine marquée à la polyhistidine à partir de Streptococcus mutans

Résumé

Source : Murata, T., et al. Purification d’une protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre une procédure étape par étape pour la purification d’une protéine marquée à la polyhistidine sécrétée par Streptococcus mutans.

Protocole

1. Concentrer les protéines du surnageant de culture par précipitation de sulfate d’ammonium.
   NOTE: Extrait des corps cellulaires si une protéine cible est intracellulaire.
   1. Centrifuger la suspension de culture bactérienne (Streptococcus mutans) pendant 20 min à 10 000 x g à 4 °C. Récupérer le surnageant de culture dans un bécher en verre de 3 L.
   2. Ajouter 1 122 g de sulfate d’ammonium à 2 L de surnageant (saturation à 80 %) en agitant vigoureusement à l’aide d’un agitateur magnétique. Laisser former le précipité pendant 4 h ou plus à 4 °C en agitant.
      NOTE: La formation de précipités peut se poursuivre pendant la nuit.
   3. Centrifuger la solution précipitée de sulfate d’ammonium à 15 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Décanter le surnageant.
   4. Recueillir le précipité à l’aide d’une spatule et le transférer dans un bécher en verre de 200 ml. Remettre les pastilles en suspension dans 35 mL de tampon de liaison (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8,0).
   5. Dialyser la suspension contre 2 500 mL de tampon de liaison à l’aide d’une tubulure de dialyse en cellulose régénérée, à 4 °C, avec agitation. Remplacez la solution de dialyse après 2 h et poursuivez la dialyse pendant la nuit.
   6. Remplacez à nouveau la solution de dialyse. Continuez à dialyser pendant 2 heures supplémentaires.
2. Centrifuger la suspension dialysée à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Filtrer le surnageant à travers un filtre à membrane à l’aide d’un équipement de filtration par aspiration. Transvaser le filtrat dans une fiole de^{75 cm 2} .
3. Fractionner la glucosyltransférase-SI MARQUÉE À LA POLYHISTIDINE (GTF-SI) de la suspension filtrée par chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC).
   1. Transvaser 2 mL de la suspension de résine IMAC chargée en Ni (environ 1 mL de résine) dans une colonne chromatographique dont la sortie est fixée à un tube en silicone. Retirer la solution de stockage par gravité.
      PRUDENCE: Ne laissez pas la résine sécher dans tout l’IMAC.
   2. Ajoutez 3 ml d’eau distillée dans la colonne pour laver la résine. Ajouter 5 mL de tampon de liaison pour équilibrer la résine.
   3. Coupez le débit avec un robinet de pincement Hoffmann. Ajouter 5 mL de la suspension filtrée de l’étape 2 pour faire la bouillie.
   4. Ajoutez toute la boue à la suspension filtrée restante. Agitez doucement le mélange pendant 30 min à 4 °C.
   5. Rechargez le mélange sur la colonne. Retirez la suspension par l’écoulement par gravité. Lavez la résine IMAC avec 20 ml de tampon de liaison.
      NOTE: Ajustez le débit à environ 2 ml/min à l’aide d’un robinet à pince Hoffmann tout au long de l’IMAC suivant.
   6. Éluer le GTF-SI recombinant avec 20 mL de tampon d’élution (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8,0).
      NOTE: Le protocole peut être mis en pause ici. L’éluat doit être stocké à 4 °C. La résine IMAC peut être réutilisée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Unité d’ultrafiltration centrifuge	Sartorius	VS2032	Remplacement du tampon et concentration en protéines
Centrifugeuse	Kubota	7780II
Colonne chromatographique	Bio-Rad	7321010	Pour IMAC
Pince à membrane de dialyse	Marque Fisher	21-153-100
Tubulure de dialyse	Comme un seul homme	2-316-06
Imidazole	Wako	095-00015	Tampon de liaison et préparation du tampon d’élution
Incubateur	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Réglage de la température : 37 °C
Microcentrifugeuse	Kubota	3740
Chlorure de sodim	Wako	191-01665	Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution
Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté	Wako	192-02815	Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution
Hydroxyde de sodium	Wako	198-13765	Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution
Sulfate d’ammonium	Wako	015-06737	Précipitation du sulfate d’ammonium
Résine chargée de nickel	Bio-Rad	1560133	Pour IMAC
Filtre à membrane	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm de diamètre