Mesure de la liaison d’un médicament au caséum à partir de lésions tuberculeuses par la méthode de dialyse à équilibre rapide

Résumé

Source : Sarathy, J. P. et al. Un test de liaison in vitro Caseum qui prédit la pénétration du médicament dans les lésions de tuberculose. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente un test in vitro permettant de mesurer la liaison d’un médicament au caseum à partir de lésions de tuberculose à l’aide d’une dialyse d’équilibre rapide. Il décrit les étapes de préparation des suspensions de caséum, d’exécution de la dialyse et de calcul de la fraction médicamenteuse non liée pour prédire la pénétration du médicament dans le caséum.

Protocole

1. Dosage de la dialyse à équilibrage rapide (RED)

1. Injecter 6,5 μL de la solution de 500 μM du composé d’essai dans 643,5 μL de l’homogénat pour atteindre la concentration finale de 5 μM (≤1 % de DMSO) et vortex.
2. Placez les inserts RED dans la plaque de base. Ajoutez 200 μL de la matrice enrichie du médicament dans la chambre donneuse (anneau rouge) de chaque insert RED et 350 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque chambre réceptrice. Préparez 3 inserts pour chaque composé d’essai (échantillons en trois exemplaires). Sceller la plaque avec une plaque adhésive et incuber à 37 °C sur le thermomélangeur à 200 tr/min (1 x g) pendant 4 h.
3. Après l’incubation, mélangez doucement le contenu des chambres donneuse et réceptrice en pipetant de haut en bas 2 à 3 fois. Pipeter 20 μL d’aliquotes d’homogénat des chambres donneuses et les ajouter à 20 μL de PBS propre dans un tube de 1,5 mL (1:1). De même, pipetez 20 μL d’aliquotes d’échantillons PBS à partir des chambres réceptrices et ajoutez-les à 20 μL d’homogénat propre (appariement matriciel).
   NOTE: L’appariement matriciel élimine le besoin de 2 courbes d’étalonnage distinctes (dans l’homogénat et le PBS) pour l’analyse quantitative. Le contenu de la chambre donneuse peut sédimenter avec le temps. Mélangez délicatement le contenu par pipetage avant de prélever les aliquotes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de base réutilisable pour dispositif Pierce RED	Fisher Scientific	Référence : PI-89811
Inserts pour appareils Pierce RED, 50/boîte	Fisher Scientific	Référence : PI-89809
Outil de retrait d’insert Pierce RED	Fisher Scientific	89812
Joint de plaque adhésive	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10 x 500 mL (Gibco)	Technologies de la vie	10010-049
DMSO	Sigma	472301