Microscopie microfluidique time-lapse pour étudier la persistance des antibiotiques chez les bactéries

Abstract

Source : Oms, T., et al. Analyse de la population et de la cellule unique de la persistance des antibiotiques chez Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo présente un protocole de surveillance de cellules bactériennes individuelles exprimant une protéine de liaison à l’ADN marquée par fluorescence au sein d’un système microfluidique. Il illustre comment les antibiotiques inhibent la plupart des cellules, tandis qu’une sous-population de cellules persistantes survit au traitement et repousse après l’élimination des antibiotiques.

Protocol

Imagerie microfluidique par microscopie time-lapse

NOTE: La section suivante décrit la préparation de la plaque microfluidique ainsi que la procédure d’acquisition et d’analyse d’images en accéléré. Le but de cette expérience est d’observer et d’analyser le phénotype de persistance lors d’un traitement antibiotique au niveau de la cellule unique. Les données recueillies au cours de cette expérience peuvent être utilisées pour générer une large gamme de résultats en fonction de la question abordée et/ou des rapporteurs fluorescents utilisés pendant l’expérience. Dans l’expérience décrite ici, une analyse quantitative de la longueur des cellules et de la fluorescence de HU-mCherry, reflétant l’organisation nucléoïde dans les cellules persistantes et non persistantes, a été effectuée.

1. Culture cellulaire bactérienne pour la microscopie microfluidique time-lapse
   1. Inculquer 5 mL de milieu (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS) glycérol 0,4 %, complété par un antibiotique sélectif si nécessaire) avec une colonie isolée dans un tube de verre (≥25 mL), et placer le tube dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 tr/min pendant la nuit (entre 15 h et 19 h).
   2. Le lendemain, mesurez la DO_{de 600} nm et diluez la culture dans un milieu frais ajusté à la température (37 °C, MOPS glycérol 0,4 %) dans un tube en verre jusqu’à une DO finale_{de 600} nm de ~0,001. Laissez la culture pousser pendant une nuit (entre 15 h et 19 h) dans un incubateur agitant à 37 °C et 180 tr/min pour obtenir une culture précoce en phase exponentielle le lendemain.
2. Préparation de la plaque microfluidique et imagerie par microscopie time-lapse
   NOTE: Les expériences microfluidiques peuvent être réalisées dans des dispositifs microfluidiques disponibles dans le commerce (comme décrit ici) ou dans des systèmes microfluidiques produits en interne.
   1. Retirez la solution de conservation (le cas échéant) de chaque puits de la plaque microfluidique et remplacez-la par un milieu de culture frais.
      NOTE: Si la plaque microfluidique contient un puits de sortie des déchets, la solution de conservation du puits de sortie doit être éliminée mais pas remplacée par le fluide.
   2. Scellez la plaque microfluidique avec le système de collecteur en cliquant sur le bouton Sceller ou via le logiciel microfluidique (sélectionnez d’abord Outil, puis Sceller la plaque).
      NOTE: Pour sceller la plaque, une pression uniforme doit être appliquée sur la plaque et le collecteur en pressant manuellement la plaque contre le collecteur. S’il est effectué correctement, la mention « scellé » devrait apparaître sur l’interface ONIX2. Il est important de ne pas appliquer de pression sur la glissière de verre pour éviter tout risque potentiel de rupture du collecteur.
   3. Une fois scellé, effectuez une première séquence d’amorçage (cliquez sur Run Liquid Amoring Sequence sur l’interface du logiciel microfluidique).
      REMARQUE : La séquence d’amorçage liquide correspond à 5 min de perfusion à 6,9 kPa pour les puits 1 à 5, suivis de 5 min de perfusion à 6,9 kPa pour le puits 8 et d’un dernier cycle de perfusion pour le puits 6 pendant 5 min à 6,9 kPa. La séquence d’amorçage liquide permet d’éliminer la solution de conservation qui peut encore être présente dans les canaux reliant les différents puits.
   4. Incuber la plaque dans une armoire thermostatique du microscope à la température souhaitée (ici, 37 °C) pendant au moins 2 h avant le début de l’imagerie microscopique.
   5. Démarrez une deuxième séquence d’amorçage liquide avant de commencer l’expérience.
   6. Scellez la plaque microfluidique en cliquant sur Seal off sur l’interface du logiciel microfluidique. Remplacer le milieu dans les puits 1 et 2 par 200 μL de milieu frais, dans le puits 3 par 200 μL de milieu frais contenant l’antibiotique (ici, l’ofloxacine (OFX) à 5 μg·mL⁻¹), dans les puits 4 et 5 par 200 μL de milieu frais, dans le puits 6 par 200 μL de milieu frais, et dans le puits 8 avec 200 μL de l’échantillon de culture (de l’étape 1.2) dilué à une DO₆₀₀ nm de 0,01 dans le milieu frais.
   7. Scellez la plaque microfluidique comme décrit à l’étape 2.2 et placez-la sur l’objectif du microscope à l’intérieur de l’armoire du microscope.
      NOTE: Assurez-vous de placer une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope avant de placer la plaque microfluidique.
   8. Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur Cell Loading pour autoriser le chargement des cellules dans la plaque microfluidique.
      NOTE: L’étape de chargement cellulaire comprend 15 s de perfusion à 13,8 kPa pour le puits 8, suivies de 15 s de perfusion à 27,6 kPa pour le puits 6 et le puits 8, et d’un dernier cycle de perfusion pour le puits 6 pendant 30 s à 6,9 kPa. La densité des cellules dans la plaque microfluidique est essentielle pour l’expérience. La première partie de ce protocole microfluidique consiste à faire pousser des bactéries pendant 6 h dans un milieu frais avant le traitement antibiotique. Après 6 h de croissance, la densité cellulaire doit être suffisante pour détecter les cellules persistantes rares (dans les conditions utilisées dans cette étude, les cellules persistantes se génèrent à une fréquence de 10⁻⁴). Si la densité cellulaire est trop élevée, il est difficile de distinguer les cellules individuelles, ce qui empêche une analyse précise de la cellule unique. Comme le taux de croissance dépend directement du milieu, la densité des cellules dans les champs de microscopie doit être évaluée avant de lancer l’expérience.
   9. Définissez une mise au point optimale à l’aide du mode lumière transmise et sélectionnez plusieurs régions d’intérêt (ROI) où un numéro de cellule approprié est observé (jusqu’à 300 cellules par champ).
      NOTE: Sélectionnez au moins 40 zones d’intérêt pour vous assurer que les cellules persistantes rares sont imagées.
   10. Sur le logiciel microfluidique, cliquez sur Créer un protocole. Programmez l’injection du milieu frais à 6,9 kPa pendant 6 h (puits 1-2), suivie de l’injection du milieu contenant l’antibiotique à 6,9 kPa pendant 6 h (puits 3), et, enfin, l’injection du milieu frais à 6,9 kPa pendant 20 h (puits 4-5).
       NOTE: Une culture bactérienne diluée à une DO_{de 600} nm de 0,01 permet aux bactéries de se développer dans la chambre microfluidique pendant 6 h, garantissant que les cellules sont dans la phase de croissance exponentielle. En fonction du nombre de cellules introduites dans le dispositif microfluidique lors de l’étape de chargement (voir étape 2.8), la durée de la phase de croissance peut être adaptée pour obtenir jusqu’à 300 cellules par ROI. La persistance étant un phénomène rare, l’augmentation du nombre de cellules par ROI améliore la possibilité d’observer des cellules persistantes. Le nombre de cellules ne doit toutefois pas dépasser 300 cellules par retour sur investissement, car cela rend l’analyse d’une seule cellule fastidieuse.
   11. Effectuez une imagerie microscopique en mode time-lapse avec une image toutes les 15 minutes en utilisant la lumière transmise et la source lumineuse d’excitation du rapporteur fluorescent. Ici, une source lumineuse d’excitation de 560 nm pour le signal mCherry a été utilisée (LED 580 nm à 10 % de puissance avec filtre 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] et une exposition de 100 ms pour mCherry). Le logiciel Zen3.2, compatible avec Zeiss, a été utilisé pour l’imagerie cellulaire.
3. Analyse d’images
   NOTE: L’ouverture et la visualisation des images de microscopie sont effectuées à l’aide du logiciel open source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). L’analyse quantitative des images est effectuée à l’aide du logiciel open source ImageJ/Fiji et du plugin gratuit MicrobeJ (https://microbej.com). Dans ce protocole, la version MicrobeJ 5.13I(14) a été utilisée.
   1. Ouvrez le logiciel ImageJ/Fiji sur l’ordinateur et faites glisser les images de microscopie time-lapse hyperstack dans la barre de chargement Fidji. Utilisez Image > Color > Make Composite pour fusionner les différents canaux de l’hyperstack. Si les canaux de l’expérience time-lapse ne correspondent pas à la couleur souhaitée (par exemple, le contraste de phase est affiché en rouge au lieu de gris), utilisez Image > Couleur > Disposition des canaux pour appliquer la couleur appropriée aux canaux.
   2. Ouvrez le plugin MicrobeJ et détectez les cellules bactériennes à l’aide de l’interface d’édition manuelle. Supprimez les cellules détectées automatiquement et tracez manuellement le contour des cellules persistantes d’intérêt image par image.
      NOTE: Différents paramètres peuvent être utilisés pour détecter automatiquement des cellules individuelles. La détection manuelle a été utilisée ici, car les cellules persistantes analysées forment de longs filaments, qui sont rarement détectés correctement à l’aide de la détection automatique.
   3. Après la détection, utilisez l’icône Result dans l’interface d’édition manuelle de MicrobeJ pour générer une table ResultJ. Enregistrez le fichier ResultJ et utilisez-le pour obtenir des informations sur les différents paramètres d’intérêt dans l’analyse de cellule unique. Dans ce protocole, la fluorescence moyenne de l’intensité HU-mCherry, la longueur des cellules et la surface cellulaire des cellules individuelles ont été exportées.

Materials