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1. Génération de la protéine fluorescente verte (GFP) Souche rapporteure de Pseudomonas aeruginosa
- Inoculer 5 ml de milieu de bouillon de lysogénie (LB) avec une seule colonie de P. aeruginosa et incuber toute la nuit à 37 °C en agitant à 200 tr/min.
- Transvaser 2 ml de la culture de nuit dans 200 ml de milieu LB frais dans une fiole de 1 L et incuber à 37 °C en agitant à 200 tr/min.
- Surveiller la densité optique à 600 nm (OD600) toutes les 30 min en prélevant un échantillon de 1 ml dans le ballon et en l’examinant à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Lorsque l’OD600 atteint entre 0,3 et 0,5, placez 40 ml de la culture dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
- Granulez les cellules en les centrifugeant à 8 000 tr/min pendant 10 min à 4 °C, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 40 ml de solution de saccharose stérile et glacée de 300 mM.
- Granulez les cellules une deuxième fois par centrifugation comme décrit à l’étape 1.5 et mettez-les en suspension dans 20 ml de solution de saccharose stérile et glacée de 300 mM.
- Granulez les cellules une dernière fois par centrifugation comme décrit à l’étape 1.5 et mettez-les en suspension dans 400 μl de solution de saccharose stérile et glacée de 300 mM.
Remarque : La densité cellulaire à ce stade doit être d’environ 1 x 1011 unités formant colonies par millilitre (UFC/ml). - Réfrigérez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes, après quoi elles sont prêtes pour l’électroporation.
- Ajouter 1 μl d’une solution plasmidique de 0,2 μg/μl de pCdrA ::gfpC à 40 μl de cellules électrocompétentes de P. aeruginosa préparées ci-dessus dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml qui a été pré-refroidi sur de la glace. Mélangez la suspension et transférez-la dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie de 2 mm.
- Enlevez l’humidité à l’extérieur de la cuvette avec du papier de soie et placez la cuvette dans la chambre d’échantillonnage de l’électroporateur. Impulsion avec une tension de 2,5 kV, une capacité de 25 μF et une résistance de 200 Ω.
- Retirez la cuvette et ajoutez 1 ml de milieu LB. Ensuite, transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml et incubez pendant 2 heures à 37 °C en agitant à 200 tr/min.
- Étalez 10 μl, 50 μl et 100 μl d’aliquotes de la culture sur des plaques stériles de gélose LB enrichies d’ampicilline (à une concentration de 100 μg/ml), et incubez les plaques à 37 °C pendant la nuit.
- Confirmez l’expression de la GFP (excitation à 485 nm, émission à 520 nm) en examinant la plaque sous un microscope à fluorescence avec un canal GFP standard, et choisissez une seule colonie pour inoculer 5 mL LB. Incuber pendant la nuit comme décrit à l’étape 1.1. Mélangez 0,5 ml de la culture de nuit avec 0,5 ml de glycérol à 50 % dans un tube à vis de 2 ml et conservez à -80 °C.
2. Préparation de la culture de démarrage pour l’inoculation
- Deux jours avant le dépistage, déposer la souche de P. aeruginosa (contenant le plasmide pCdrA ::gfpC ) du stock à -80 °C sur une plaque de gélose LB (complétée par de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml) en répartissant doucement les bactéries sur la plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile. Incuber la plaque toute la nuit à 37 °C.
- La veille du dépistage, inoculer une seule colonie de P. aeruginosa de la plaque dans 10 ml de milieu LB (complété par de l’ampicilline à une concentration de 100 μg/ml) dans un tube et incuber la pré-culture pendant la nuit à 37 °C en agitant à 200 tr/min.
- Le jour de l’écran, préparez une sous-culture à partir de la pré-culture de nuit en la diluant d’abord avec du milieu LB frais jusqu’à une DO600 de 1,0, puis en diluant davantage avec 5 % de LB jusqu’à une DO600 de 0,04 (rapport 1:25).
Remarque : Le volume total du milieu inoculé dépend du nombre de plaques à tester. 5 % LB est fabriqué en diluant 100 % LB avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à la concentration requise. Il est important de noter que le milieu (5 % LB) permet l’activation constitutive de pCdrA ::gfpC chez P. aeruginosa. - Ajoutez une barre d’agitation magnétique stérile dans le récipient et remuez la culture à vitesse minimale sur un agitateur magnétique pendant 30 minutes à température ambiante, permettant aux bactéries de s’acclimater au milieu avant d’être distribuées dans des plaques de 384 puits.
3. Inoculation et incubation des plaques à 384 puits contenant de petites molécules
Remarque : La stérilité et de bonnes techniques d’asepsie sont primordiales pour les étapes suivantes.
- Pour préparer le témoin positif (inhibition à 100 %), ajoutez 20 μl de sulfate de tobramycine (25 mg/ml) à 10 ml (adéquat pour un maximum de 12 plaques) de la sous-culture préparée à l’étape 2.3 et mélangez délicatement. Pipeter 40 μl de la culture témoin positive dans les puits A23-P23 (Figure 1).
- Pour préparer le témoin négatif (inhibition de 0 %), ajouter 30 μl de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 ml (suffisant pour un maximum de 12 plaques) de la sous-culture préparée à l’étape 2.3 et mélanger délicatement. Pipette 40 μl de la culture témoin négative dans les puits A24-P24 (Figure 1).
- Pour chacune des plaques estampillées avec les petites molécules, inoculer un volume de 40 μl des cultures diluées pendant la nuit (décrites à l’étape 2.3) dans les puits A1-P22 (figure 1).
Remarque : Cela peut être réalisé à l’aide d’un robot manipulateur de liquides. En raison des propriétés hétérogènes des cultures bactériennes, il est important de maintenir une agitation continue et modérée pour maintenir la répartition constante des bactéries dans le milieu pendant la distribution. Pour ce faire, continuez à remuer magnétiquement la culture acclimatée de l’étape 2.4 pendant la distribution. - Scellez les plaques avec un joint de couvercle perméable à l’air et incubez pendant 6 heures à 37 °C.
Remarque : Le joint perméable à l’air est essentiel pour maintenir des conditions immuables dans les 384 puits et pour contourner le développement potentiel de gradients d’oxygène à travers la plaque.
4. Mesure de la croissance (OD600) et du niveau c-di-GMP intracellulaire (GFP)
- Environ 30 minutes avant la mesure spectrophotométrique, préchauffez le lecteur de plaques à 37 °C pour éviter la condensation.
- Retirez délicatement le joint du couvercle perméable à l’air avant de lire. Mesurez la densité optique à une longueur d’onde de 600 nm avec un réglage de 10 flashs par puits et un temps de stabilisation de 0,2 seconde.
- Avant de mesurer la fluorescence, effectuez un réglage automatique du gain et de la focale en fonction du puits A24 (contrôle négatif) et réglez la valeur cible de gain à 75 % (Figure 1).
- À partir du logiciel de contrôle du lecteur de plaques, cliquez sur démarrer la mesure et cliquez sur l’onglet ''Réglage de la mise au point et du gain/ID de la plaque''.
- Sélectionnez ''Réglage de la mise au point'' et ''Canal A'' à droite de la fenêtre.
- Sélectionnez ''Réglage du gain'' et ''Bien sélectionné'', et tapez ''75'' comme ''Valeur cible''. Enfin, choisissez bien A24 dans la disposition de la plaque avant de cliquer sur ''Démarrer le réglage''. Une fois le réglage effectué, cliquez sur ''Démarrer la mesure''.
- Mesurez la fluorescence du rapporteur GFP à un maximum d’excitation/émission de 485/520 nm avec un réglage de 10 flashs par puits et un temps de stabilisation de 0,2 sec.
- Recueillir des données sur toutes les plaques examinées.
Remarque : Les relevés de données sont automatiquement enregistrés par défaut par le logiciel de contrôle du lecteur de plaques.- Consultez les lectures en cliquant sur l’icône « Mars » dans le logiciel de contrôle pour ouvrir le progiciel d’analyse statistique.
- Récupérez les données en « double-cliquant » sur le numéro de plaque qui vous intéresse pour accéder aux données à analyser.
